鞣酸对糖尿病大鼠肾脏功能和形态改变的影响

　　　　 作者：魏海峰 李才 魏雁虹 曲萌 苗春生 孙波

【摘要】 目的 观察鞣酸（tannic acid，TA）对链脲佐菌素（STZ）诱发糖尿病（DM）大鼠血糖及肾脏功能和形态改变的影响。方法 用STZ诱发大鼠DM模型后，随机分为DM模型组、氨基胍（AG）组和TA低高剂量组，另设正常对照组。AG组按40 mg·kg-1·d-1给予；TA低高剂量组分别按20及30 mg·kg-1·d-1给予；正常对照组和模型组每天给予等体积生理盐水，给药方式均为腹腔注射，共10 w。观察给药期间及10 w后大鼠的一般状况，检测各组大鼠血糖、血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、24 h尿蛋白及观察肾脏形态学变化。结果 TA可改善DM大鼠基本状况，与模型组比较，TA组血糖、血清Cr、BUN和尿Cr、尿蛋白均明显降低，光镜和电镜下观察显示，模型组大鼠较正常对照组大鼠肾小球明显增大，细胞数目增多，基底膜节段性增厚，部分足突融合。TA组上述异常均明显减轻。结论 TA可明显降低尿蛋白排泄，改善DM大鼠肾脏功能和形态学异常，对DM大鼠具有肾脏保护作用。

【关键词】 鞣酸；糖尿病；血糖；肾功能

　　糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）常见而又严重的并发症之一，也是导致终末期肾脏疾病的常见病因〔1〕。DN发病机制十分复杂，目前药物对DN的治疗疗效仍不尽满意。我国药典上收载的五倍子鞣质，称为鞣酸或单宁酸（tannic acid，TA），广泛存在于植物界，约70%以上的中草药及某些食物中均含有此类化合物。目前已知，TA在医药学领域具有止血愈伤、抑菌抗病毒、抗氧化、延缓衰老等功效〔2〕，但TA对DN发生发展的影响尚不明确。本文观察TA对DM大鼠血糖、肾脏功能和结构改变的改善作用，为应用TA防治DN提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型的建立

　　雄性Wistar大鼠70只，体重180～220 g，购自吉林大学实验动物中心。适应性饲养1 w后，随机选取8只作为正常对照组，予标准饲料喂养。其余62只禁食12 h，链脲佐菌素（STZ，购自Sigma公司）按52 mg/kg体重（使用前用0.1 mol/L、pH4.2无菌柠檬酸盐缓冲液配成2%溶液）单次腹腔注射，正常对照组大鼠仅腹腔注射等体积0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液。注射STZ后48 h，用尿糖试纸测尿糖，应在及以上，1 w后DM大鼠表现多饮、多食、多尿和体重明显减轻，再次测定尿糖，尿糖≥、血糖值≥16.67 mmol/L者确定为DM模型大鼠，给予标准饲料、充足的饮用水饲养，用于下一步的实验。造模期间有4只大鼠死亡，7只大鼠血糖值偏低，未列入实验对象。

　　1.2 动物分组及给药方法

　　成模的51只DM大鼠随机分为DM模型组15只，氨基胍（AG）（40 mg·kg-1·d-1）组、TA低高剂量（20及30 mg·kg-1·d-1）组各12只。药液的配制：AG及TA均购自Sigma公司，注射前用0.1 mol/L PBS溶液配制2%AG溶液及1%TA溶液，以NaOH调整溶液pH7.0，超净台下用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。正常对照组和模型组每天给予等剂量的生理盐水，各组给药方式均为腹腔注射，为期10 w。实验期间动物自由进食饮水，未使用胰岛素及其他降糖药物。

　　1.3 观察指标及方法

　　①每日观察动物精神状态、毛色、饮食情况、尿量、活动情况，每周称量一次各组大鼠体重。②分别于给药第2、4及10周后尾静脉取血，利用北京诒成血糖仪检测血糖水平。③实验结束时大鼠称重，取血后处死，立即摘取右肾称重，计算肾重/体重比值；血液生化指标的测定：处死动物后眼球取血，2 000 r/min离心10 min，吸取血清分装于Eppendorf管中，采用日立7150型全自动生化仪检测各组大鼠血清肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）、尿酸（UA）；尿蛋白测定：给药10 w后处死动物，处死前将大鼠放入基础代谢笼内，禁食，不禁水，收集大鼠24 h尿液，记录尿量后留取3 ml，1 500 r/min离心10 min，去除沉渣，分装于Eppendorf管中，采用日立7150型全自动生化仪检测尿蛋白（Urine Protein），计算24 h尿蛋白排泄量。④大鼠取血后处死，立即摘取肾脏，置于4%多聚甲醛中固定48 h，常规制备石蜡切片，行组织形态学检查，包括HE、Masson染色。同时各组取少量肾组织经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，Eppon 812环氧树脂包埋，LKBⅢ型超薄切片机半薄切片定位后行超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，JEM1200EX型透射电子显微镜观察、摄片，观察肾小球超微结构的变化。

　　1.4 统计学方法

　　数据用x±s表示，采用SPSS13.0软件进行组间方差分析。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠一般状况

　　正常对照组大鼠饮食饮水及二便正常，精神状态良好，毛色光润，反应敏捷，体重增加，无死亡。注射STZ造模后72 h，大部分大鼠出现多饮、多尿，活动减少，体毛枯燥无光泽，精神萎靡，反应迟钝，拱背蜷卧。实验期间及结束，模型组大鼠“三多一少”症状未得到缓解，体重明显降低，体毛松散无光泽，状态差，死亡7只。AG及TA组大鼠也有相似的表现，但活动较模型组活跃，实验后期饮水及尿量有所减少。死亡情况为：AG组死亡4只，TA低剂量组死亡3只，TA高剂量组死亡5只，两种药物治疗组之间无明显差别。

　　2.2 各组大鼠肾脏指数的变化

　　DM大鼠体重明显减轻，肾脏体积增大，重量增加，明显大于正常对照组（P<0.01）。TA组大鼠体重减轻程度不如模型组明显，肾脏肾体积和重量较模型组显著降低（P<0.01），TA高低剂量组与AG组无明显差别。见表1。表1 各组大鼠体重、肾重、肾重/体重、不同病程大鼠血糖水平及生化指标的比较 (略)

　　2.3 TA对不同病程的大鼠血糖的影响

　　各组DM大鼠空腹血糖明显高于正常对照组（P<0.01），与模型组相比，TA处理2 w后，对DM大鼠的血糖改善不明显，随着治疗时间的延长，至第4周及实验结束（10 w），血糖明显降低。见表1。表1 各组大鼠体重、肾重、肾重/体重、不同病程大鼠血糖水平及生化指标的比较 (略)

　　2.4 各组大鼠肾脏功能的比较

　　各组DM大鼠血清Cr、BUN、UA含量和24 h尿蛋白排泄量均明显高于正常对照组，TA处理10 w后的DM大鼠，血Cr、BUN和尿蛋白排泄量均有不同程度改善。见表1。表1 各组大鼠体重、肾重、肾重/体重、不同病程大鼠血糖水平及生化指标的比较 (略)

　　2.5 各组大鼠光镜和电镜观察结果

　　光镜下见模型组肾小球体积增大，系膜基质增生，肾小囊腔呈裂隙状，肾小管管腔扩张，上皮细胞空泡变性和间质轻度纤维组织增生。TA组较模型组有很大程度改善，肾小球体积增大不明显，仅有轻度系膜增生。见图1。电镜观察下，正常对照组肾小球基膜内、中、外三层结构清晰、完整，基膜不增厚，系膜区不扩大，系膜基质无明显增多，血管内皮细胞、足细胞、系膜细胞未见异常，上皮足突分布均匀。肾小管上皮细胞未见肿胀及细胞核、细胞器的改变。模型组大鼠肾小球基膜三层结构不清，肾小球基底膜呈节段性明显增厚，并可见云雾状电子致密物沉积，内皮细胞局部增生呈连拱状改变，部分上皮细胞足突融合。肾小管细胞核内染色质边集，胞内溶酶体增多、部分变性，线粒体肿胀，嵴断裂，空泡化。TA组可见少量基膜呈节段性增厚，足突基本正常，系膜细胞及基质未见明显增生，部分肾小管可见胞体内溶酶体增多，其余部分未见明显异常。见图2。

　　3 讨论
　　
　　DN是DM微血管病变所致，其发病机制比较复杂〔3〕。早期DN的主要表现为肾脏肥大和肾小球高滤过，肾小球结构出现改变，基膜增厚和系膜基质增多，尿白蛋白排泄率正常或出现微量白蛋白尿。随着病情的进展，肾小球滤过率开始下降，出现大量白蛋白尿，基膜增厚和系膜基质增加更加明显，临床出现进行性增加的非选择性蛋白尿，肾功能逐渐减退，至终末期也即尿毒症期，多数肾单位闭锁，血尿素氮、肌酐升高，血压升高。有效地防止或延缓DN的发生、发展，是延长DM患者寿命、提高其生活质量的重要措施。
　　
　　一次足量给予动物STZ可造成胰岛β细胞大量破坏，胰岛素合成和分泌减少，引起糖代谢紊乱，从而导致DM。本实验造模成功，在整个实验过程中，DM模型组大鼠的血糖稳定在较高的水平，多饮多食多尿，体重减轻等DM症状明显，至实验结束时，DM大鼠肾脏重量和肾肥大指数及血清Cr、BUN、尿蛋白水平等均较正常对照组明显增加，电镜下见肾小球基膜节段性增厚，电子致密物沉积和部分足突融合。表明成模的DM大鼠已进入早期DN阶段。给予TA后，治疗组大鼠的一般状态较模型组有所好转，肾脏的病理改变明显减轻，肾脏重量和肾肥大指数较DM组显著降低。Chandak等〔4〕研究显示，DM大鼠用TA处理4 w后，可显著降低血糖，但没有明显改善血清Cr及尿蛋白排泄水平。本实验结果发现TA处理10 w不但可以明显降低DM大鼠的血糖水平，而且对血清Cr、BUN及尿蛋白均有一定改善作用。以上实验结果表明，TA对DM大鼠具有一定的肾脏保护作用，能减轻肾脏肥大、基膜增厚等早期DN病理改变，降低尿白蛋白，从而延缓DN的进展和恶化。
　　
　　DN的发病一般认为是多因素所致，主要包括代谢紊乱、肾小球血流动力学改变和遗传易感性等，其中高血糖可能是DN的始动因素〔5〕。以往的研究认为，某些中药或食物中的TA成分，具有降低血糖、血压及尿酸，调整脂代谢等作用〔6〕，本实验表明TA可以有效控制DM大鼠的血糖，因此我们推测TA对DM大鼠肾脏病理改变的减轻作用可能是通过其对糖代谢的调节，控制血糖而使DN得到逆转。目前已知，DN的发病与氧化应激、硝基应激及DM肾脏微炎症密切相关〔7〕，具有抗炎、抗氧化作用的TA改善肾功能的作用是否是通过改善DM的氧化及硝基应激状态，减轻DN的炎症反应，有待于近一步研究。此外，多聚(ADP核糖)聚合酶（PARP）的激活在DN的发病过程中扮演着重要的角色，使用PARP抑制剂可以有效改善DM大鼠肾脏功能，降低DM的氧化应激水平〔8〕，Shevalye等〔9〕使用一种名为GPI154，27的PARP抑制剂，结果发现其可以降低转化生长因子（TGF）β、血管内皮细胞生长（VEGF）、纤连蛋白的表达，但对ICAM1、硝基应激水平等没有明显改善，提示不同种PARP抑制剂的联合应用将对DN的防治具有重要意义。有文献报道〔4〕，TA同样可以作为PARP的抑制剂，防止其激活，但具体的作用机制尚不明确。总之，深入探讨TA在防治DN方面的作用，有望为临床防治DM并发症提供新的思路和应用。

参考文献

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　　4 Chandak PG，Gaikwad AB，Tikoo K，et al.Gallotannin ameliorates the development of streptozotocininduced diabetic nephropathy by preventing the activation of PARP〔J〕.Phytother Res，2009；23(1):727.

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　　9 Shevalye H，Stavniichuk R，Xu W，et al.Poly(ADPribose) polymerase (PARP) inhibition counteracts multiple manifestations of kidney disease in longterm streptozotocindiabetic rat model〔J〕.Biochem Pharmacol，2009；27.〔Epub ahead of print〕.