哌嗪雌酚酮对骨质疏松小鼠骨和子宫的影响

　　　　　　 作者：张延娇 李青南 郑虎 翁玲玲

【摘要】 目的 研究新型雌激素——哌嗪雌酚酮（PE）对去卵巢骨质疏松小鼠骨代谢及子宫的影响。方法 将60只昆明种小鼠，体重30～35 g，随机分6组，正常对照组，去卵巢模型组(Ovx组)，Ovx+PE 0.5 mg/kg组，Ovx+PE 1.0 mg/kg组，Ovx+PE 2.0 mg/kg组，Ovx+雌酚酮（E）0.71 mg/kg组。去卵巢后连续灌胃给药42 d，处死小鼠后行骨代谢相关指标检测、骨组织胶原染色及子宫病理学检查。结果 PE能预防去卵巢小鼠的骨丢失，高剂量组有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，中、高剂量组能够显著的提高去卵巢小鼠骨内羟脯氨酸的含量(P<0.01，P<0.05)；对单位骨重骨钙、骨磷含量无明显影响；与雌酚酮组比较，对骨质疏松小鼠子宫的作用较弱。结论 PE主要是通过提高骨组织胶原的含量维持骨量，对子宫表现出弱刺激作用。

【关键词】 哌嗪雌酚酮；骨质疏松；去卵巢；骨；子宫

　　绝经后妇女骨质疏松的发病率为50%，其病因主要是绝经后卵巢功能减退、雌激素水平降低引起骨质丢失。雌激素替代疗法(ERT)是防治绝经后骨质疏松最传统、最经典的方案〔1，2〕。然而，长期应用雌激素会增加乳腺癌和子宫内膜癌的风险。因此，寻找选择性高、副作用小的防治骨质疏松药物，成为目前新药研发的热点之一。哌嗪雌酚酮（PE）是一种新的雌激素衍生物〔3〕，既往采用骨形态计量学方法证实了其对大鼠骨丢失的预防作用〔4〕。本实验以骨质疏松小鼠为动物模型，通过对骨基质的分析及骨胶原排布的影响探讨PE对绝经后骨质疏松防治的疗效。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组

　　雌性昆明种（KM）小鼠60只（本院动物中心提供），体重30～35 g，将小鼠随机分成6组：正常对照组(Sham组，5‰羧甲基纤维素钠)、去卵巢模型组（Ovx组，5‰羧甲基纤维素钠）、去卵巢+PE低(PEL，Ovx+PE 0.5 mg/kg)、中(PEM，Ovx+PE 1.0 mg/kg)、高剂量组(PEH，Ovx+PE 2.0 mg/kg)和去卵巢+雌酚酮组(E组，Ovx+E 0.71 mg/kg)。对应组分别连续灌胃给药42 d，右心室采血，处死。

　　1.2 实验药品及试剂

　　PE（纯品），由四川大学华西药学院提供； 5‰羧甲基纤维素钠购于上海化学试剂厂；羟脯氨酸（Hyp）测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；Direct Red 80购于Sigma公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 骨组织参数的测定

　　1.3.1.1 股骨湿重（BWW）

　　将软组织剥除干净的左侧股骨，于1/10万分析天平上测其湿重。

　　1.3.1.2 股骨干重(BDW)

　　取左侧股骨，除净附着骨上的肌肉和软组织，用AE240电子天平称量湿重后于80℃烤箱烘烤72 h至恒重，称量此时骨重可得出股骨干重。

　　1.3.1.3 骨Hyp及骨钙(Ca)、骨磷（P）测定方法

　　取左侧股骨，除净附着肌肉和软组织，于80℃烤箱烘烤48 h至恒重，然后将每份骨标本置于10 ml安瓿瓶中加入6 mol/L HCl 5 ml，乙炔火烧安瓿瓶口密封后置于烤箱中，108℃恒温消化24 h后取出过滤，取滤液，然后将滤液分成两份，一份以1∶10稀释后用ICP(电感耦合等离子体直读光谱仪)测定微量元素的含量，根据标准品含量及样品稀释倍数计算出骨中Ca2+、P的含量；另一份滤液以1∶10稀释，调pH值至7.0～7.4后，按照Hyp测定试剂盒方法用UV752紫外分光光度计测定样品中Hyp吸光度，计算样品中Hyp含量。

　　1.3.2 骨胶原形态学观察〔5〕

　　脱钙骨制片：取右侧股骨，多聚甲醛液中固定72 h后，置于15%EDTA脱钙液中脱钙4 w（换新鲜EDTA脱钙液1次/w），脱钙后流水冲洗过夜，10%中性福尔马林液固定过夜，骨组织脱水，预浸蜡3 h，浸蜡3 h，包埋，修整蜡块后切片。各组的股骨下1/3段在矢状面石蜡切片，裱于明胶玻片上行天狼猩红(Direct Red 80)胶原染色。

　　1.3.3 子宫组织病理学检查

　　将各组雌性小鼠的每个双角子宫分别取上中段约1 cm组织，然后经过常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡、包埋，修整蜡块后切片。子宫采用横切面连续切片，切片厚度均为4 μm。HE染色步骤染色，中性树胶封片。在光学显微镜下观察不同组的子宫组织的变化。

　　1.4 统计学方法

　　数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件分析，数据经正态性和方差齐性检验后，采用单因素方差分析(onewayANOVA)的最小显著差法LSD进行组间比较。

　　2 结果

　　2.1 股骨代谢指标结果

　　见表1。表1 PE对骨质疏松小鼠股骨指标的影响(略)

　　2.1.1 去卵巢模型组的变化

　　与Sham组比较，Ovx组BWW、BDW明显降低（P<0.05），Hyp含量减少，有统计学意义（P<0.01），而单位骨的Hyp、Ca、P的含量则无明显变化；PEH组及E组的BDW、BWW增加明显，具有统计学意义。

　　2.1.2 E组的效应

　　与Ovx组比较，E组的骨重量和Hyp的含量增加，但对单位骨重的相关骨成分变化不明显，不具备统计学意义；虽能增加P、Ca的含量也未表现出统计学意义。

　　2.1.3 PE对骨质疏松小鼠的作用

　　与Ovx组比较，PE能增加骨重量，但以PEH组具有统计学意义，股骨中Hyp含量增加明显，其中以PEM组作用最为显著（P<0.01）。但单位骨重的Hyp、Ca、P变化不明显。

　　2.2 股骨形态学观察结果

　　偏振光下可见Ovx组胶原纤维断裂、变短、稀疏，排列紊乱，呈现出淡红或黄色。胶原染色也呈现出较强烈的红色折光，纤维连续，排列规律。PEM组骨基质胶原纤维呈现强烈的红色双折光，纤维连续、粗大，连接紧密，排列规律。见图1。

　　2.3 子宫和子宫内膜的变化

　　见表2。表2 PE对骨质疏松小鼠子宫内膜的影响(略)

　　2.3.1 Ovx组的变化

　　与Sham组比较，Ovx组的子宫指数、内膜高度、腺上皮高度、内膜上皮高度均降低。子宫内膜明显萎缩，腺体少，腺体细胞多为低柱状。

　　2.3.2 E的作用

　　与Ovx组比较，E明显增加子宫的重量近10倍；与Sham组比较，子宫组织各项指标也明显增加，其中腺上皮高度具有统计学意义。

　　2.3.3 PE对子宫作用

　　与Ovx组比较，PE各组动物子宫指数、子宫内膜厚度、内膜高度、腺上皮高度都有一定的增加，具有一定剂量依赖性，PEM、PEH组作用具有统计学意义，但明显小于Sham组和E组。与E组比较，子宫内膜变薄，内膜高度、腺体数量和腺上皮高度均明显降低。

　　3 讨论

　　3.1 去卵巢小鼠绝经后骨质疏松动物模型的建立

　　骨质疏松是以单位的骨量降低，骨基质的有机成分生成不足，继发钙盐减少为特征。本实验采用KM小鼠，双侧卵巢切除6 w后与Sham组比较骨重明显降低，骨基质成分和矿物质呈现比例性减少，子宫明显萎缩。表明去卵巢骨质疏松小鼠动物模型已成功建立。

　　3.2 PE对骨质疏松小鼠骨代谢的影响

　　PEM、PEH组骨量明显增加，单位骨重的Ca、P无明显影响，PEM组股骨中Hyp的含量增高明显，表明其促骨胶原合成作用较为明显。骨中的胶原分子多呈有序的平行排列，骨组织胶原的分布及交联度对骨结构产生重要的影响〔6〕。苦味酸天狼猩红偏振光方法可以揭示组织内的胶原类型和分布状态。脱钙骨的组织切片经苦味酸天狼猩红染色后，在偏振光显微镜下可见胶原显示不同的干涉光，可以观察胶原性状的改变。偏振光下观察苦味酸天狼猩红骨胶原染色结果表明，PEM组骨基质内胶原纤维呈现强烈的红色双择光，骨胶原纤维排列走向更规则，这与PEM组对股骨中Hyp含量的影响一致。而阳性对照E组，骨量明显提高，单位骨重下Ca、P的含量有所提高，骨胶原的含量未表现增加。这与传统雌激素降低骨转化，增加了骨基质的矿化程度有关。然而，降低骨转换结果是骨更新减少，骨脆性增加，这不符合骨骼生理的变化规律。PE防治骨质疏松的作用有别于传统的雌激素，通过提高骨质疏松小鼠股骨有机基质含量而改善骨的延性和韧性，骨矿盐含量未见增加，这可能与其具有促成骨活性〔7〕及骨矿化的周期相对较长有关〔8〕。

　　3.3 PE对骨质疏松小鼠子宫的影响

　　对于Ovx小鼠子宫，中和高剂量PE表现出一定雌激素活性，具有一定的剂量依赖性，但其对子宫的刺激作用明显弱于等摩尔剂量下的阳性对照药物E，仅表现为弱的雌激素活性。
　　
　　当前，对药物安全性的要求越来越高，在开发防治骨质疏松药物的过程中既能保留雌激素对骨骼系统的积极作用，又降低其潜在的危险性是雌激素类抗骨质疏松药物研发的重点。本研究证实PEM组能够增加骨胶原含量并改善骨的结构和功能，减少骨量丢失，有效防治Ovx引起的骨质疏松，但对生殖系统仅表现出弱的雌激素活性。因此，E引入哌嗪环合成的这种新型雌激素衍生物，增强了雌激素对骨的靶向性作用，其对骨的作用有别于传统雌激素，同时降低了对生殖系统的风险，该化合物有望成为一种相对安全的，主要用于防治妇女绝经后骨质疏松的新药。

参考文献

　　1 Balasch J.Sex steroids and bone:current perspectives〔J〕.Hum Report Update，2003；9(3):207.

　　2 Studd J.Estrogens as firstchoice therapy for osteoporosis prevention and treatment in women under 60〔J〕.Climacteric，2009;12(3):2102.

　　3 李灵芝，郑 虎，翁玲玲.雌激素哌嗪类衍生物的合成及其促骨生长活性〔J〕.中国药物化学杂志，2000；10(1):3845.

　　4 李青南，翁玲玲，黄连芳，等.哌嗪雌酚酮对去卵巢大鼠骨代谢的作用〔J〕.药学学报，2003；38(3):1614.

　　5 许增禄.显示胶原及其类型的苦味酸天狼猩红－偏震光方法〔J〕.基础医学与临床，1996;16(1)：756.

　　6 谢 斌，陈允震，刘海春.骨胶原在骨质疏松中的作用〔J〕.中国老年学杂志，2009;29（16）:20579.

　　7 吴晓蓉，李青南，翁玲玲，等.新合成化合物哌嗪雌酚酮对老年大鼠骨代谢的作用〔J〕.生物医学工程杂志，2005;22(2):502.

　　8 郭世绂.股质量与骨质疏松症〔J〕.国外医学·内分泌学分册，2005;25(5):2957.