慢性愤怒应激对衰老大鼠学习记忆能力的影响及其脂质过氧化机制

　　　　 作者：詹向红 李伟 徐玮玮 赵君玫 杨雪 刘胜利

【摘要】 目的 观察慢性愤怒应激对D半乳糖(Dgal)引起的衰老大鼠空间学习记忆能力的影响，并从脂质过氧化与抗氧化角度解释其作用机制。方法 采用夹尾间接激怒法诱导被攻击大鼠产生愤怒应激，观察慢性愤怒应激对衰老大鼠空间学习记忆能力和血清SOD活性及心、肝组织MDA、LPF含量的影响，分析心、肝MDA、LPF含量与血清SOD活性的相关性。结果 愤怒Dgal组大鼠较Dgal组寻台时间显著延长（P＜0.05），血清SOD活性显著降低（P＜0.05），心、肝组织MDA、LPF含量显著提高（P＜0.05，P＜0.01），心、肝MDA、LPF含量与血清SOD活性呈负相关。结论 慢性愤怒应激可降低衰老大鼠的学习记忆能力，加速衰老进程。抑制机体抗氧化能力，加重心、肝等重要脏器组织脂质过氧化可能是其机制之一。

【关键词】 愤怒应激；衰老；学习记忆能力；脂质过氧化

　　随着生活节奏加快、社会竞争激烈，人们的心理冲突逐渐增多，情绪调节不良对生命过程的影响受到关注。中医学认为，肝主疏泄，调畅全身气机，是情志调节的核心。那么，情志内伤对机体衰老进程有无影响？其机制如何？愤怒是负性情绪的核心，对个体及社会的危害尤为突出，许多重大的身心疾病可以追溯到情绪的长期愤愤不平。本研究从愤怒入手，选择氧化与抗氧化指标探讨慢性愤怒应激对大鼠衰老进程的影响及其部分机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验仪器与试剂

　　TU1901双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Morris水迷宫（参照文献〔1〕自制）；D半乳糖（Dgalactose，Dgal）（生物工程上海有限公司提供）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、脂褐素（LPF）测定试剂盒（均由南京建成生物工程研究所提供）。

　　1.2 动物及分组

　　清洁级3月龄Wistar雄性大鼠48只（河北医科大学实验动物中心提供），体重为（270±10）g。按体重随机分为3组：正常对照组10只，Dgal组和愤怒Dgal组各12只（长期激惹打斗可致大鼠死亡），剩余14只作为入侵鼠（长期夹尾刺激可致大鼠尾部损伤），各组分笼饲养，自由饮食。

　　1.3 Dgal模型制备

　　按李文彬等〔2〕Dgal衰老和脑老化造模方法。Dgal组和愤怒Dgal组大鼠自实验开始即给予Dgal，行亚急性衰老及脑老化造模。Dgal 0.1 g·kg-1·d-1连续颈后部皮下多点注射6 w，正常对照组注射同体积生理盐水。

　　1.4 慢性愤怒应激引入

　　参照顾立刚〔3〕等夹尾间接激怒法通过改良引入长期愤怒应激。具体方法如下：自第3周开始每日下午3：00，将愤怒Dgal组大鼠单独放入代谢笼内，另外随机放进1只入侵鼠，用纱布包裹止血钳钳夹入侵鼠鼠尾，入侵鼠被激惹，对愤怒Dgal组大鼠发起攻击，双方互相对峙、打斗甚至撕咬，产生愤怒心理和行为，每日刺激时间为20 min，连续4 w。最后入侵鼠丢弃不用。

　　1.5 Morris水迷宫测试

　　参照李文彬〔2〕等实验方法，第37天开始进行空间学习记忆能力测试，为期6 d。

　　1.6 SOD、MDA、LPF检测

　　实验至第43天，停药、禁食24 h，称重，摘眼球取血4～5 ml，静置、离心，吸取上层血清，－80℃保存，用于测定血清SOD活性。然后用脱颈椎法处死大鼠，迅速解剖动物，摘取心脏、肝右叶置于－80℃冰箱保存，用于检测心、肝组织匀浆MDA、LPF含量。血清SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法；心、肝组织匀浆MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法；心、肝组织匀浆LPF含量测定采用荧光法，均依照试剂盒说明书步骤进行检测。

　　1.7 统计学分析

　　采用SPSS13.0统计分析软件进行处理。数据资料应用x±s表示。数值变量组间均数差异的比较，服从正态分布和方差齐采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)，两两比较用最小显著差(LSD)法。以SOD为因变量，心、肝MDA、LPF为自变量进行Logistic回归分析。

　　2 结果

　　2.1 慢性愤怒应激对衰老大鼠空间学习记忆能力的影响

　　正常对照组寻台时间(SPL)为(8.07±2.28) s，Dgal组SPL为(16.29±6.04) s与Dgal组相比，愤怒Dgal组大鼠SPL〔(23.21±9.48) s〕明显延长，组间比较差异显著（P＜0.05）。

　　2.2 愤怒应激对衰老大鼠血清SOD活性及心、肝组织MDA、LPF含量的影响

　　与Dgal组相比，愤怒Dgal组大鼠血清SOD活性显著降低（P＜0.05），心、肝组织MDA和LPF含量显著增高（P＜0.05，P＜0.01），见表1。表1 各组大鼠血清SOD活性及心、肝组织MDA、LPF含量比较(略)

　　2.3 各组大鼠心、肝组织MDA、LPF含量与血清SOD活性的相关性分析 大鼠心、肝组织MDA、LPF含量与血清SOD活性呈负相关，见表2。表2 心、肝组织MDA、LPF含量与血清SOD活性的相关性（略）

　　3 讨论

　　衰老发生机制的自由基损伤学说于1956年由Denham首先提出，认为衰老是由于自由基损伤及其诱发的脂质过氧化造成的。SOD是氧自由基的专一清除剂，在一定程度上具有防止衰老的作用。MDA是脂质过氧化终产物之一，其含量反映氧自由基水平和过氧化反应的强度和速率，是了解自由基导致机体组织细胞损伤程度的重要指标。MDA及其复合物被溶酶体吞噬后形成的残余物质累积形成LPF，使细胞结构呈退行性改变，加速细胞老化过程。
　　
　　衰老动物模型的建立是衰老病因病机研究的基础，Dgal模型属于衰老的氧自由基模型〔4，5〕，目前国内外多采用此方法建立大鼠衰老模型〔6，7〕。本课题组利用此模型对不同治法的抗氧化能力进行了比较研究，发现长期给予Dgal的确可使小鼠SOD活性下降，过氧化反应增强，脂质过氧化物增多而发生拟老化效应。益气健脾方药和益气健脾祛痰化瘀方药均能明显提高SOD活性、减少MDA和LPF含量，缓解氧应激状态〔8，9〕。
　　
　　一般认为，Morris水迷宫测试对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，是判断空间学习记忆能力的有力工具〔1〕。本实验Morris水迷宫测试结果显示：与Dgal组相比，愤怒Dgal组大鼠SPL明显延长。表明慢性愤怒应激可降低衰老大鼠的学习记忆等认知能力，加速衰老进程。
　　
　　为揭示慢性愤怒应激加速衰老进程的可能机制，本研究关注大鼠的脂质过氧化和抗氧化功能，实验结果显示：持续愤怒应激可使Dgal衰老大鼠血清SOD活性降低，心、肝组织MDA、LPF含量升高，并且心、肝MDA、LPF含量与血清SOD活性呈负相关。提示慢性愤怒应激可诱发机体重要脏器脂质过氧化、抑制机体抗氧化能力，这可能是慢性愤怒应激加速衰老进程的机制之一。同时，临床检测血清SOD活性可用于评价全身抗氧化功能状态，并有助于推测心、肝等重要脏器的脂质过氧化水平。

参考文献

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　　3 顾立刚，古宇环，李乐东，等.长期激怒刺激对大鼠全血黏度和巨噬细胞功能影响的研究〔J〕.北京中医药大学学报，1997；20(2):2830.

　　4 石 娟，魏敏杰.D半乳糖与衰老研究的进展及临床意义〔J〕.中国老年学杂志，2009；29（15）:20013.

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　　8 詹向红，杨 靖，赵君玫.益气健脾方药对D半乳糖拟衰老小鼠自由基代谢及免疫功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2005；25(8):9334.

　　9 詹向红，裴晓华.益气健脾祛痰化瘀方药对Dgal拟衰小鼠自由基代谢及免疫功能的影响〔J〕.中华中医药杂志，2005；20（12）:7489.