蛇葡萄素（AMP)对SPCA1细胞增殖的抑制作用

　　　　 作者：吴建军 任润珍 刘凯 刘永琦 吴勇杰

【摘要】 目的 检测蛇葡萄素(Ampelopsin，Amp)对人小细胞肺癌细胞(SPCA1)的细胞毒性，并初步探讨其作用机制。方法 采用MTT比色法检测Amp（12.5～200 μg/ml)对SPCA1细胞的增殖抑制作用。应用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率和细胞周期变化。用HE染色和透射电镜观察蛇葡萄素单用和与卡铂联用引起的人SPCA1的形态学变化。应用共聚焦显微镜检测Amp（50，100 μg/ml)对SPCA1细胞内Ca2＋、H＋和线粒体膜电位的影响。结果 Amp以浓度、时间依赖性地抑制SPCA1细胞的增殖，以浓度依赖性地引起细胞凋亡率的升高，使细胞周期阻滞于G2/M期。Amp（100 μg/ml)有诱导细胞凋亡的作用，出现明显的凋亡晚期特征即凋亡小体。与对照组比较，Amp引起细胞内Ca2+、H+浓度升高和线粒体膜电位降低。 结论 Amp可抑制SPCA1细胞增殖，同时诱导凋亡发生，此作用可能与细胞阻滞于G2/M期、Ca2＋和H＋升高有关。

【关键词】 蛇葡萄素(Amp)；SPCA1细胞；增殖抑制

　　黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛地存在于药用植物的根、叶、皮、果实中，以游离或与糖结合为苷的形式存在〔1〕。该类化合物不仅种类数量繁多，而且结构复杂多样，表现出多种生理活性〔2〕。蛇葡萄素(Amp) 属于小分子黄酮类化合物，是指两个苯环通过中央三碳链相互连结而成的C6C3C6化合物〔3〕。研究证实，Amp对酪氨酸激酶有强烈的抑制作用〔4〕，并在一系列的抗肿瘤实验中得以体现〔5〕。本实验研究了Amp对小细胞肺癌（SPCA1)细胞增殖的抑制作用，并初步探讨其作用机制，为Amp在临床上的最终开发应用提供了依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　Amp由广东泰禾医药科技有限公司 (040513) 提供，纯度97% 以上； SPCA1细胞由兰州大学药学院药理学教研室提供；注射用卡铂，购自齐鲁制药有限公司 (04100161)； RPMI 1640培养基，购自Invitrogen公司；新生牛血清，购自杭州四季青公司； 噻唑蓝（MTT)、碘化丙啶（PI)，Sigma公司；荧光探针均购自Molecular Probe公司。其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱，Shellab公司；相差倒置显微镜，Olympus 公司；ELX180酶标仪，BLOTEK Instruments公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组和给药方法

　　取对数生长期细胞，细胞数为4×104/ml，加入96孔细胞培养板，分为对照组、试验药物组、阳性药物组，24 h后分别加入5% 的DMSO、Amp（12.5～200 μg/ml)、卡铂。

　　1.2.2 Amp对SPCA1细胞的抑制作用

　　依上法处理细胞，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下分别培养48、72 h，每孔加入10 μl MTT（5 mg/ml)，4 h后每孔加入10%的十二烷基硫酸钠(SDS) 100 μl，充分振荡，用酶标仪在570 nm处测定OD值，计算抑制率。抑制率 (IR) =〔1-(用药孔平均吸光度)/(对照孔平均吸光度)〕×100%。

　　1.2.3 Amp对SPCA1细胞凋亡和细胞周期的影响

　　将对数生长期的SPCA1细胞用不含血清的新鲜培养液培养8 h，使细胞停止增殖。处理、收集细胞，PBS洗三次，充分制悬细胞，用70%的冷乙醇进行固定。测定时冷PBS洗三次，收集细胞加入含有核糖核酸酶(RNase)的PI（50 mg/L)溶液0.5 ml（细胞浓度＞106/ml)，室温下避光30 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡及各期细胞百分率。

　　1.2.4 透射电子显微镜检查

　　37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养到24 h细胞完全贴壁后加药。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养48 h后，收集培养液离心(1 000 r/min)，弃上清，保留细胞沉淀待用；消化各组培养瓶中的细胞，按实验分组一一对应，与培养液中收集的细胞沉淀混合，再次离心(1 000 r/min)，弃上清液。用PBS液轻轻吹洗收集的细胞转移至Eppendorf管中，再洗1次后，再次离心(1 000 r/min)，并弃上清液。细胞沉淀中加入5%的戊二醛固定液，4℃保存待检。将固定的细胞离心，用PBS清洗2遍，弃上清液，加入1%锇酸于沉淀中固定1 h。丙酮梯度脱水，将细胞置于丙酮∶包埋剂（1∶1)中置换30 min。用纯包埋剂浸泡2 h，制作超薄切片，用醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色。透射电镜观察细胞形态。

　　1.2.5 荧光探针的配制

　　处理、收集细胞，用培养液洗3次，加入呋喃3乙酰羟甲基酯 AM(F1242)，羧基SNARF1/AM pH值指示剂(C1272)，线粒体绿色(M7514)荧光探针，37℃孵育30 min，用用培养液洗三次，收集细胞，应用共聚焦激光显微镜检测Ca2＋、H＋和线粒体膜电位。

　　1.3 统计学分析

　　所有数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。应用SPSS13.0统计软件处理。

　　2 结果

　　2.1 Amp对SPCA1细胞的抑制作用及IC50 Amp以浓度、时间依赖性地趋势抑制SPCA1细胞的增殖。见表1。表1 Amp对SPCA1细胞的抑制率及IC50（略)

　　2.2 Amp对SPCA1凋亡百分率和细胞周期的影响

　　阴性对照组、阳性药物组、Amp 50、100 μg/ml组细胞凋亡率分别为0.2%、19.7%、25.2%、40.6%。与对照组比较，Amp 50、100 μg/ml引起SPCA1细胞其凋亡率明显升高（P＜0.05)。见表2。表2 Amp对SPCA1细胞凋亡率及细胞周期的影响（略）

　　2.3 透射电镜观察细胞形态变化

　　阴性对照组，细胞微绒毛丰富，胞质中细胞器丰富，核活跃，核膜比较清晰完整；与对照组比较，Amp（100 μg/ml)作用48 h后，核染色质聚集，胞质中大量线粒体肿胀增大。

　　2.4 Amp对SPCA1细胞内Ca2+、H+和线粒体膜电位的影响

　　3 讨论
　　
　　Amp为一种小分子黄酮类化合物，是在粤蛇葡萄中提取的单体化合物。文献报道，Amp对多种肿瘤细胞有抑制作用，进一步的研究发现其对肿瘤细胞的抑制作用与抑制酪氨酸酶活性有关〔4，5〕。在某种程度上，Ca2+是生命活动中各条信号转导的枢纽。多种细胞的凋亡都显示了细胞内Ca2+浓度持续不断的升高，而钙拮抗剂又能抑制细胞凋亡。Ca2+浓度的变化可能在细胞程序性死亡过程中有启动作用〔6，7〕。线粒体在细胞凋亡中扮演着重要角色，哺乳动物细胞的凋亡，目前人们普遍接受的死亡机制有两条途径，其中一条即是线粒体途径。线粒体膜电位下降，提示其凋亡作用机制可能与诱发细胞色素C释放的线粒体途径有关。同时ATP耗竭，水平下降， H+泵失活，使细胞内H+浓度升高〔8〕。本研究表明，Amp可抑制SPCA1细胞增殖，诱导细胞凋亡发生，这都与细胞阻滞于G2/M期、Ca2＋和H＋升高有关。

参考文献

　　1 曹良启，王晓黎，刘德育.黄酮类化合物诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展〔J〕.中药材，2004；27(10):7858.

　　2 李云霞，贺文智，索全伶，等.黄酮类化合物活性及构效关系研究概况〔J〕.内蒙古石油化工，2004；30：102.

　　3 何桂霞，杨伟丽，裴 刚.蛇葡萄属药用植物研究进展〔J〕.湖南林业科技，2003；30(4)：3941.

　　4 刘德育，雷焕强.杨梅黄素及蛇葡萄素对酪氨酸酶的抑制作用〔J〕.生物化学杂志，1996;12(5):61821.

　　5 刘德育，罗 曼，谢冰芬，等.蛇葡萄素的抗肿瘤作用研究〔J〕.癌症，2001;20(12):13725

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　　7 Giannakis C，Forbers IJ，Zalewski PD，et al.Ca2+/Mg2+dependent nucleas：tissue distribution，relationship to internucleosomal DNA fragmentation and inhibition by Zn2+〔J〕.Biochem Biophy Res Commun，1991；181(2):91520.

　　8 罗建东，郑平香，陈 修，等.细胞内pH与细胞凋亡〔J〕.生命科学，1997；9
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