低分子量肝素对E选择素介导的HL60细胞与血管内皮细胞黏附的影响

　　　　　　 作者：宋宝辉 张晓莉 付德才

【摘要】 目的 研究低分子量肝素（LMWH）对E选择素介导的 HL60 细胞与血管内皮细胞黏附的影响。方法 通过原代培养方法分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并建立体外模拟毛细血管流动的层流体系，利用该体系观察LMWH对体外动态条件下 HL60 细胞与 TNFα 诱导的 HUVEC 的黏附作用的影响，荧光读板仪测定LMWH对E选择素表达的影响。结果 TNFα 处理 HUVEC 5 h，能明显增加 HL60细胞与 HUVEC 在动态条件下黏附，并能明显促进 HUVEC 表面 E选择素表达。0.1、1 mg/ml对 HL60细胞体外黏附有明显抑制作用；0.01、0.1、1 mg/ml对脐静脉内皮 E选择素的表达有明显抑制作用。结论 LMWH有明显抑制体外动态条件下 HL60细胞与人脐静脉内皮细胞黏附及降低血管内皮细胞 E选择素表达的作用。这一结果为LMWH作为抗炎药物，尤其是为以选择素作为药物作用靶点应用于临床提供了重要的实验基础。

【关键词】 低分子量肝素；细胞黏附；人脐静脉内皮细胞；E选择素

　　细胞黏附是机体的重要生理现象，而白细胞与血管内皮细胞的黏附对维持机体正常活动以及介导炎症发生具有重要作用〔1～3〕。血流状态下的白细胞黏附是一个多步骤的复杂的级联反应过程，多种黏附分子家族参与了这一过程。其中，选择素家族主要在白细胞起始黏附阶段发挥作用。由于选择素的重要作用，以选择素为靶点的抗黏附治疗已成为当前治疗非特异性炎症的研究热点〔4〕。低分子量肝素 (low molecular weight heparin，LMWH) 是近年来发展起来的一类新型生化药物，是由肝素分级或降解而成的低分子量的组分或片段，分子量一般为3 000～8 000。已有的研究表明，LMWH 可抑制中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，但相关分子机制有待深入研究〔5～7〕。本实验在体外动态条件下，研究LMWH 对 E选择素介导的白细胞起始黏附的影响，为 LMWH 应用于临床提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　IMDM、RPMI 1640 培养基(美国 Gibco)，低分子量肝素钠注射液40 mg/0.4 ml(法国AVENTIS Pharma Specialites)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型胶原酶、凝血酶(美国 Sigma)，急性髓性白血病细胞系(HL60)由本室保存，96 和 48 孔细胞培养板(美国 Costar)，塑料培养瓶（美国 Corning），荧光读板仪（GE Healthcare），倒置显微镜（日本 Nikon），CO2恒温培养箱(美国 Nuaire)，彩色视频摄像装置（日本 Panasonic），平行板流动小室（美国 GlycoTech），人 PECAM1单抗，人VEcadheri 单抗（美国 eBioscience），E选择素阻断性单抗（美国Santa Cruz），其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　①HL60 细胞培养于含 10 % 胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃5%CO2的细胞培养箱中培养。②人脐静脉内皮细胞（HUVEC）原代培养按Jaffe等〔8〕的方法加以改进。在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃ PBS(0.01 mol/L，pH7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.1 %胶原酶混合消化液 8～10 ml使血管充盈，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃ 孵育 15 min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入 50 ml锥形离心管中，加入胎牛血清2 ml终止酶反应。再以30 ml PBS冲洗管腔，流出液倒入离心管，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清，加入含有 10 % 胎牛血清的IMDM培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1 ml细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1×105/ml接种至塑料培养瓶，置于5%CO2，37℃静止培养12 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔 2 d换液1次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。PECAM1和VEcadheri免疫荧光染色鉴定呈阳性，取3代细胞用于实验。

　　1.2.2 体外模拟毛细血管的层流实验

　　用体外模拟毛细血管的层流实验测定HL60细胞与HUVEC黏附作用。所有用于层流实验的单细胞悬液密度均为1×106个/ml，HUVEC单层用TNFα（20 ng/ml）刺激5 h使之表达高水平的E选择素。将覆盖有HUVEC的35 mm培养皿装配于平行板流动小室，然后放置在倒置显微镜的载物台上。倒置显微镜连接有彩色视频摄像装置，可以将视频图像传送到录像机，并可用相连的计算机显示器同步观察。首先用注射泵注入PBS（0.1% BSA）冲洗平行板流动小室约 2 min，然后以 1.0 dyn/cm2流速注入HL60细胞单细胞悬液，整个系统保持在22℃。当 HL60 细胞进入视野3 min后，随机选定10～20个区域（10倍），记录黏附于HUVCE单层的白细胞，最后通过观看录像人工计数。在抗体阻断、LMWH 抑制的实验中，HL60细胞先与mAb（20 μg/ml）及不同浓度的LMWH室温预孵化30 min。

　　1.2.3 LMWH对HUVEC表面E选择素表达的影响

　　用LMWH处理 TNFα(20 ng/ml) 活化的96孔板内融合成单层的HUVEC 5 h，每组3个复孔，PBS洗1次，分别加E选择素单克隆抗体（HAE1f）20 μl/孔，37℃ ，孵育1 h，PBS冲洗。再加1∶50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30 min，PBS冲洗，然后利用荧光读板仪测荧光强度。

　　1.3 统计分析

　　实验数据以x±s表示。平均值间统计的显著性检验采用ANOVA（方差）检验。如果平均值有显著差异，则通过 Tukey Test 进行多比较成对检验。所有数据均经SPSS13.0统计分析软件包处理。

　　2 结果

　　2.1 HUVEC原代培养及鉴定

　　在倒置显微镜下可观察到，利用Ⅰ型胶原酶消化下HUVEC最初以5～20个细胞的薄片状样结构存在，将消化下来的HUVEC以 2×104个/ml的密度接种于24孔塑料培养板各孔内，待8 h后大部分细胞已经贴壁。早期贴壁的细胞呈小多角、球形，呈团状，少数细胞伸展，此时给细胞换液以去除混入的红细胞等杂质。当培养至24 h时细胞已明显伸展，48～72 h生长最快，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有漩涡状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2个核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。培养5 d后融合成细胞单层，呈典型的铺路石状排列。传代培养后的细胞和原代细胞相比无明显变化。免疫荧光标记实验表明，PECAM1和VEcadherin　两种特异性抗原均表达在细胞上，表明培养的细胞为HUVEC。见图1。

　　2.2 LMWH抑制E选择素介导的白细胞在动态条件下与HUVEC黏附

　　当HUVEC受20 ng/ml TNFα刺激后，明显增加了HL60细胞的滚动数量。E选择素阻断性单克隆抗体 HAE1f与 TNFα 刺激的HUVCE的预孵化可以明显减少 HL60 细胞的滚动数量，表明这一滚动由E选择素特异性介导。以上结果表明，TNFα 刺激后可提高E选择素介导的 HL60 细胞在HUVCE表面的滚动数量。并且LMWH与HUVEC预孵化可明显降低 E选择素介导的HL60细胞的滚动数量。见图2。

　　2.3 LMWH对HUVEC E选择素表达的影响

　　TNFα 单独刺激 HUVEC 5 h，HUVEC表面E选择素表达明显升高，而LMWH和TNFα共同作用后能明显抑制HUVEC 表面E选择素表达。表明LWMH 可通过抑制E选择素表达抑制 HL60 细胞与 HUVEC 在动态条件下黏附。见图3。

　　3 讨论
　　
　　肝素是一种高度硫酸化的阴离子糖胺聚糖，具有多种显著的生物活性，尤其是作为抗凝药物在临床上的广泛使用已经将近70年。肝素除了为人所熟知的抗凝活性外，还具有较好的抗炎及抗肿瘤转移活性。作为一些黏附分子的配体（例如选择素和整合素）竞争性抑制黏附分子与其天然配体的结合是其抑制炎症发生及肿瘤转移分子机制的一个重要因素。但是，肝素强烈的抗凝血活性带来的潜在的出血危险极大地限制了它作为抗炎及抗肿瘤药物的广泛应用。
　　
　　近年来的研究表明，LMWH及一些修饰肝素在降低其抗凝血活性的同时保留了有效地抗炎及抗肿瘤转移活性〔9〕。一些研究报道了LMWH可通过抑制黏附分子(如ICAM1)在血管内皮细胞表达而影响白细胞与血管内皮细胞黏附〔7〕。但是，除了ICAM1外血管内皮细胞还表达多种黏附分子，例如与白细胞起始黏附密切相关的E选择素。LMWH是否可以通过抑制E选择素在血管内皮细胞表达进而影响白细胞黏附并不清楚。为此，在这一研究中通过原代培养HUVEC建立了体外模拟毛细血管血液流动的层流体系，并利用这一体系检验了LMWH对E选择素介导的白细胞与血管内皮细胞黏附的影响。结果显示，LMWH在动态条件下可显著抑制E选择素介导的HL60细胞与血管内皮细胞之间的相互作用，表明LMWH具有抑制E选择素介导白细胞黏附的生物学特性。为了确定这种抑制作用是否通过影响E选择素表达而发挥作用，利用荧光酶标仪检测了其对TNFα诱导的HUVEC E选择素表达的影响。结果显示，LMWH与HUVEC预孵化可明显降低E选择素表达。结合已有的报道〔10〕，推测LMWH可能通过抑制调控E选择素表达的转录因子NFκB的活性而发挥作用。
　　
　　此外，除了E选择素其他黏附分子也参与炎症反应过程，因此不能排除LMWH通过直接或间接途径同时可以抑制这些黏附分子与其配体的相互作用，这些问题有待进一步深入研究。本研究不但证明了LMWH能有效地抑制介导的白细胞黏附，而且为深入阐明LMWH的抗炎分子机制提供了实验基础。

参考文献

　　1 Patel KD，Cuvelier SL，Wiehler S.Selectins:critical mediators of leukocyte recruitment〔J〕.Semin Immunol，2002；14(2):7381.

　　2 Zarbock A，Ley K.Neutrophil adhesion and activation under flow〔J〕. Microcirculation，2009;16 (1):3142.
　
　　3 Fabene PF，Navarro MG.A role for leukocyteendothelial adhesion mechanisms in epilepsy〔J〕.Nat Med，2008；14 (12):137783.

　　4 Ehrhardt C，Kneuer C，Bakowsky U.Selectins——an emerging target for drug delivery〔J〕.Adv Drug Deliv Rev，2004;56 (4):52749.

　　5 Maugeri N，Di Fabio G，Barbanti M，et al.Parnaparin，a lowmolecularweight heparin，prevents Pselectindependent formation of plateletleukocyte aggregates in human whole blood〔J〕.Thromb Haemost，2007；97 (6):96573.

　　6 Lever R，Lo WT，Faraidoun M，et al.Sizefractionated heparins have differential effects on human neutrophil function in vitro〔J〕.Br J Pharmacol，2007；151(6):83743.

　　7 韩秀珍，焦 波，尚 雪，等.低分子量肝素对白细胞黏附和黏附分子表达的影响〔J〕.中国生化药物杂志，2003；24（4）：17981.

　　8 Jaffe EA，Grulich J，Weksler BB，et al.Correlation between thrombininduced prostacyclin production and inositol trisphosphate and cytosolic free calcium levels in cultured human endothelial cells〔J〕.J Biol Chem，1987；25（262）:855765.

　　9 Gao Y，Li N，Fei R，et al.PSelectinmediated acute inflammation can be blocked by chemically modified heparin，ROheparin〔J〕.Mol Cells，2005;19(3):3505.

　　10 Thourani VH，Brar SS，Kennedy TP，et al.Nonanticoagulant heparin inhibits NFkappaB activation and attenuates myocardial reperfusion injury〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000；278(6)：h308493.