IL21调节免疫平衡对大肠癌细胞生长的抑制作用

　　　　作者：张振亚 张伟 陈学谦 安广权 单保恩 于跃明

【摘要】 目的 观察大肠癌患者和接种Colon26细胞小鼠的Th1/Th3平衡偏移情况，同时以IL21调整小鼠Th1/Th3平衡，观察调节细胞免疫平衡对大肠癌的影响。方法 随机选取30例大肠癌患者，采用流式细胞仪测定Th1/Th3细胞比值及血清中IFNγ和IL4浓度。另于小鼠爪垫内侧皮下接种高分泌IL21的Colon26/IL21细胞，对比观察小鼠肿瘤生长情况及对机体免疫平衡状态的影响。结果 ①30例大肠癌患者和30例正常人Th1/Th3比值分别为0.74±0.27和1.26±0.9；血清IFNγ浓度的测定值分别为（6.26±1.43）和（9.18±2.31）pg/ml；IL4浓度的测定值分别为（8.88±1.30）和（5.20±1.71）pg/ml；IFNγ/IL4比值的测定值分别为0.70±0.10和1.82±0.35，两者差异明显。②接种Colon26/IL21细胞组小鼠肿瘤持续生长至16 d后逐渐缩小，小鼠血清中IFNγ浓度明显高于对照组；接种Colon26细胞组小鼠肿瘤持续生长增大，血清中IL4浓度高于Colon26/IL21细胞组；免疫平衡向细胞免疫方向转变。结论 大肠癌患者与正常人相比细胞免疫功能下降，免疫平衡（Th1/Th3平衡）向Th3型偏移；IL21可以增强Th1型细胞免疫功能，调节Th1/Th3细胞比例，纠正免疫失衡，有效发挥杀灭肿瘤细胞。

【关键词】 免疫平衡；IL21；大肠癌； Colon26细胞

　　恶性肿瘤的发生发展常与机体的免疫功能低下有关，调节肿瘤患者机体免疫平衡，增强其细胞免疫功能有助于改善治疗效果。白介素21（IL21）主要由活化的CD4+T细胞分泌的Ⅰ型细胞因子，能够促进T细胞、NK细胞、树突细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性，加强机体细胞免疫功能。本研究旨在通过流式细胞学和ELISA方法对比观察大肠癌患者与正常人之间免疫功能的差异；并通过调节机体分泌IL21水平，观察免疫平衡状态的变化以及抑制肿瘤生长的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床实验标本的采集

　　随机选取本院院外科经病理证实的住院结肠癌患者30例，其中男17例，女13例，年龄29～74岁，中位年龄为61岁，病例排除标准：①无应用任何免疫制剂；②肠梗阻合并白细胞升高；③无合并其他部位感染；④伴乙型肝炎、类风湿关节炎、甲状腺功能亢进等与免疫相关的疾病；对照组30例均为健康人，男17例，女13例，年龄28～70岁，中位年龄为63岁，与大肠癌患者在性别、职业、年龄等方面均具有可比性（P﹥0.05）。标本采集均为空腹静脉血。血标本分成两部分：A用促凝管采血1 ml，1 500 r/min离心10 min，提取血清，80℃保存备用；B用EDTAK2抗凝的无菌试管采血1 ml，采血后即刻送实验室进行实验。

　　1.2 实验动物、细胞株

　　清洁级Balb/c雌性小鼠共90只，体重25 g左右，均购自河北医科大学实验动物中心（合格证编号：701147）。小鼠结肠低分化腺癌Colon26细胞株、转染IL21基因的Colon26细胞株（Colon26/IL21细胞）由本院科研中心单保恩教授惠赠。

　　1.3 主要仪器及试剂

　　EpicsXLⅡ型流式细胞仪，NU400400E超净工作台，倒置显微镜，高速低温离心机，CHIBITANⅡ型微量离心机，凝胶成像分析系统 ，UV2201型紫外分光光度计，DFCII型电泳仪，80℃超低温冰箱，PCR扩增仪，酶联免疫检测仪。人IFNγ、IL4、小鼠IFNγ、IL4定量ELISA试剂盒由晶美生物工程有限公司（北京）提供；FITC标记的抗CD4单抗（CD4FITC）、PE标记的抗IL4单抗（IL4PE）、PE标记的抗IFNγ单抗（IFNγPE）、佛波醇乙酯、离子霉素、蛋白转运抑制剂由美国BD公司提供；0.1%Triton X100由美国Sigma公司提供；RPMI1640培养基由Gibco公司提供；Trizol 由Invitrogen 生物技术公司提供；RTPCR酶混合物由华美生物工程公司提供；小鼠IL21基因上、下游引物由华美生物工程公司合成，上游引物为5＇GAGGACCCTTGTCTGTCTGG3＇，下游引物为5＇TCATCTTTTGAAGGAGCCATTT3＇；DNA Marker由北京鼎国生物公司提供。

　　1.4 结肠癌患者外周血Th1、Th3细胞检测

　　取患者抗凝血1 ml，以PMA、离子霉素为刺激原，加蛋白转运抑制剂后培养，裂解红细胞后洗涤后弃上清，CD4FITC单抗标记洗涤，加4%多聚甲醛固定， 0.1%Triton X100缓冲液破膜加入IFNγPE、IL4PE，室温孵育，充分洗涤后用PBS2%多聚甲醛悬浮细胞，应用EpicsXLⅡ型流式细胞仪进行检测，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm，应用Expo32ADC进行免疫荧光分析。将CD4+IFNγ+ T细胞认为Th1细胞、CD4+IL4+ T细胞认为Th3细胞，Th1/Th3比值代表机体的免疫平衡状态。同法检测对照组外周血Th1、Th3细胞和Th1/Th3细胞比值。

　　1.5 酶联免疫吸附法检测IFNγ、IL4血清浓度

　　严格按照说明书进行操作。

　　1.6 Colon26/IL21细胞株IL21基因的表达测定

　　取生长旺盛的Colon26/IL21细胞，加入Trizol溶液裂解细胞，加入氯仿振荡后静置。低温离心后取无色上层水相，加入0.5 ml异丙醇混匀静置，加入 75%乙醇，得到总 RNA（同法提取Colon26细胞总RNA）。用紫外分光光度计测定RNA的OD260 nm、OD280 nm数值。求出OD260 nm/OD280 nm比值以鉴定RNA纯度。分别取Colon26/IL21及Colon26细胞总 RNA，于琼脂糖凝胶中电泳，分析RNA完整性。分别以提取的Colon26/IL21细胞及Colon26细胞总RNA为模板，依次RNA 1.5 μl、上游引物0.9 μl、下游引物0.9 μl，酶反应混合物2 μl、MgCl2 1.0 μl、dNTP 1.2 μl。置PCR扩增仪扩增IL21 DNA。反应条件为：cDNA第一链合成37℃ 50 min；灭活反转录酶94℃ 5 min；然后进行下列循环：变性94℃ 45 s，复性66℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，循环数25；再延长72℃ 5 min。将Colon26/IL21细胞及Colon26细胞RTPCR扩增产物作电泳，观察各细胞株IL21表达的情况。

　　1.7 Colon26和Colon26/IL21细胞接种后肿瘤生长情况对比

　　取90只Balb/c小鼠，随机分为3组，每组30只，分别为Colon26组、Colon26/IL21组和空白对照组。Colon26组和Colon26/IL21组分别于小鼠爪垫内侧皮下接种Colon26细胞Colon26/IL21细胞悬液0.04 ml（5×105个细胞）；空白对照组同部位注射生理盐水0.04 ml。观察爪垫肿瘤生长情况，每隔48 h测量并记录肿瘤体积（肿瘤体积的计算公式为1/2×长×宽2）。将小鼠爪垫每次肿瘤体积观测值取平均值，绘出爪垫肿瘤体积变化曲线。于接种第24天时取血1 ml后处死，完整剥离肿瘤，称重测量Colon26组和Colon26/IL21组小鼠爪垫肿瘤重量。肿瘤组织用10%中性甲醛固定，HE染色观察接种肿瘤组织细胞学差异。

　　1.8 统计学方法

　　应用SPSS13.0软件进行两样本间的t检验和单因素方差分析。
　　
　　2 结果

　　2.1 外周血Th1、Th3细胞及Th1/ Th3比值的测定

　　测定30例结肠癌患者和30例正常人的Th1细胞数目无明显差异；结肠癌患者Th3细胞比例升高，导致机体Th1/ Th3平衡向Th3型偏移。见图1。结肠癌患者IFNγ的测定值较正常人明显降低，IL4的测定值则显著升高， IFNγ/IL4比值有显著差异（P<0.01），说明大肠癌患者较正常人细胞免疫力下降、免疫平衡向Th3型偏移。见表1。表1 两组患者外周血中Th1、Th3细胞、IFNγ、IL4检测及免疫平衡状态比较(略)

　 2.2 Colon26/IL21细胞株基因表达测定

　　Colon26/IL21细胞经RTPCR扩增所得产物在434 bp附近形成特异性条带，说明Colon26/IL21细胞株有IL21 mRNA稳定表达。见图2。

　　2.3 接种Colon26小鼠和Colon26/IL21小鼠肿瘤生长情况测定

　　小鼠接种Colon26、Colon26/IL21细胞后于爪垫均逐渐形成肿瘤。接种Colon26细胞组肿瘤持续增大，接种Colon26/IL21细胞组肿瘤于16 d达到平均体积1.3 mm3，然后逐渐缩小，两组肿瘤体积变化曲线。见图3。24 d时处死小鼠后两组肿瘤称重结果，两组肿瘤平均重量分别为（2.48±0.31），（0.27±0.10）g，差异显著（P<0.01）。

　　2.4 Colon26细胞和Colon26/IL21肿瘤组织病理学观察

　　接种Colon26细胞小鼠爪垫肿瘤组织镜下可见组织间质少，细胞排列无规律，部分组织细胞出现坏死。细胞核体积增大，胞浆与细胞核比例较正常增大，核大小不一，形态不规则，多染色深，可见病理性核分裂像，呈恶性肿瘤生长。接种Colon26/IL21细胞小鼠的肿瘤组织可见肿瘤细胞核固缩、核溶解，胞浆空泡变性；肿瘤组织萎缩，间质纤维组织增生，出现部分正常皮下组织，如皮脂腺、毛囊等，是肿瘤萎缩、消退的表现。见图4。

　　2.5 接种Colon26小鼠和接种Colon26/IL21小鼠免疫状态情况测定

　　接种Colon26细胞小鼠较正常小鼠细胞免疫力下降，免疫平衡向Th3型偏移；接种Colon26/IL21细胞小鼠增强了Th1型细胞的免疫功能，使免疫平衡状态转向Th1型，纠正了肿瘤造成的免疫平衡偏移，有效抑制了肿瘤细胞的生长。见表2。表2 接种不同种类细胞小鼠各组间 IFNγ、IL4及IFNγ/IL4 检测比较(略)

　　3 讨论

　　近年发现改善肿瘤患者免疫功能可以增强对恶性肿瘤的治疗正常情况下机体处于动态的免疫平衡状态，Th1细胞主要介导细胞免疫，通过分泌细胞因子，调节机体获得性免疫。恶性肿瘤患者的Th细胞亚群发生向Th3的漂移，机体细胞免疫受到抑制，使肿瘤逃避免疫监视。我们用流式细胞计法测定了结肠癌患者外周血Th1、Th3细胞分布情况，发现与正常组相比Th3细胞数目增加、Th1/Th3细胞数目比例下调、免疫平衡向Th3型偏移，机体不能有效杀灭肿瘤细胞，致使肿瘤不断生长，甚至发生远处转移。Onishi等〔1〕研究发现肾细胞癌患者的Th3类细胞及相应因子多高于正常平均值，同时发现Th3类细胞因子含量与肿瘤的恶性程度呈正相关。维持机体的细胞免疫功能不仅依靠Th1型细胞数目，并且其相应细胞因子的活化作用也是重要因素。本文发现与正常人相比大肠癌患者血清中IL4的水平显著升高，IFNγ/IL4比值明显下降，机体免疫功能向降低细胞免疫功能的方向偏移，与流式细胞学方法检测显示的机体免疫失衡结果相一致，结肠癌患者血清中IFNγ降低可以抑制抗原的递呈和NK细胞活化，机体杀灭肿瘤细胞能力进一步下降 〔2〕。所以肿瘤的免疫治疗的重点应以提高、恢复Th1/Th3平衡为主。通过改善和调节细胞因子水平的免疫平衡，加强肿瘤患者的评估和治疗。
　　
　　IL21与IL2、IL12、IL15、IL18具有同源性，它主要由活化的CD4+ T细胞产生，不仅能促进IFNγ的合成，还能过促进NK细胞增殖、分化以及CTL效应，抑制肿瘤的生长〔3，4〕。为了验证纠正机体免疫平衡对抑制肿瘤细胞生长的作用，我们将小鼠结肠腺癌Colon26细胞和Colon26/IL21细胞接种于小鼠爪垫，观察肿瘤的生长情况〔5〕。在肿瘤的生长过程中，发现Colon26组IL4水平较正常小鼠显著升高，IFNγ水平显著降低，导致接种的结肠肿瘤迅速生长；而Colon26/IL21组在肿瘤生长早期增长速度与Colon26组无明显差异，16 d后生长速度减慢，而后肿瘤逐渐缩小，个别个体甚至出现肿瘤完全消退，同时病理切片可见肿瘤细胞出现核固缩、核溶解，胞浆空泡变性，间质纤维组织增生，肿瘤细胞以凋亡的形式死亡。ELISA测定显示该组小鼠体内IFNγ水平显著升高，IFNγ/IL4也显著升高，免疫平衡转向Th1型。因此我们认为小鼠是通过持续分泌IL21，调节了机体的免疫平衡状态，从而发挥抑制肿瘤作用的。推测IL21调节Th1/Th3平衡的机制可能是IL21通过分布于NK细胞表面受体诱导活化NK细胞终末分化或成熟〔6〕，NK细胞发挥细胞毒活性的同时分泌大量IFNγ，并可促进CD8+T细胞的细胞毒效应〔7〕，有学者发现能表达IL21的小鼠乳腺癌接种于同源基因鼠后，同样可以促进了荷瘤鼠CD8+T细胞肿瘤特异性CTL活性和分泌IFNγ的提高，杀灭肿瘤细胞或诱导细胞凋亡〔8〕。由此可见，IL21通过诱导机体分泌了大量的IFNγ是细胞免疫途径杀伤肿瘤细胞的关键因素。在体外实验中发现，Colon26/IL21肿瘤小鼠脾细胞共培养，脾细胞分泌较对照组更多的IFNγ。IFNγ再作用抗原特异性的T细胞，使其从Th3/Th0转向Th0/Th1型转变，从而纠正Th1/Th3平衡偏移〔9〕。有人认为细胞因子基因导入肿瘤细胞使其自行分泌细胞因子，肿瘤组织局部可聚集高浓度的细胞因子，改变肿瘤局部的免疫微环境，有利于激发免疫应答，这可能亦是其抗肿瘤的一条途径。
　　
　　综上，IL21能够有效调节机体的Th1/Th3平衡状态，有望在结肠癌免疫治疗方面发挥巨大作用，免疫平衡的测定和调节为结肠癌的免疫监测和免疫治疗提供了有力的工具，具有广阔的应用前景。

参考文献

　　1 Onishi T，Ohishi Y，Imagawa K.An assessment of the immunological environment based on intratumoral cytokine production in renal cell carcinoma〔J〕.BJU Int，1999；83(4):48892.

　　2 Arrol HP，Church LD，Bacon PA，et al.Intracellular calcium signaling patterns reflect the differentiation status of human T cells〔J〕.Clin Exp Immunol，2008;153(1):8695.

　　3 Wurster AL.Interleukin 21 is a T helper （Th） cell 2 cytokine that specifically inhibits the differentiation of naive Th cells into interferon gammaproducing Th1 cells〔J〕.J Exp Med，2002；196:96977.

　　4 ParrishNovak J，Foster DC，Holly RD，et al.Interleukin21 and the IL21 receptor:novel effectors of NK and T cell responses〔J〕.J Leukoc Biol，2002；72:85663.

　　5 张振亚，张 伟，张飞春.结肠癌细胞转染基因抑瘤效应的实验研究〔J〕.中国肿瘤临床，2005；32(1)：214.

　　6 Brady J，Hayakawa Y，Smyth MJ，et al.IL21 induces the functional maturation of murine NK cells〔J〕.J Immunol，2004；172:204858.

　　7 Di Carlo E，Comes A，Orenqo AM，et al.IL21 induces tumor rejection by specific CTL and IFNgamma dependent CXC chemokines in syngeneic mice〔J〕.J Immunol，2004;172:15407.

　　8 Reome JB，Hylind JC，Dutton RW，et al.Type 1 and type 2 tumor infiltrating effector cell subpopulations in progressive breast cancer〔J〕.Clin Immunol，2004；111（1）:6981.

　　9 Lamont AG，Adorini L.IL12:a key cytokine in immune regulation〔J〕. Immunol Today，1996；17（5）:2147.