气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞bcl2及bax相关凋亡因子的表达

【摘要】 目的 观察气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞的凋亡及bcl2、bax相关凋亡因子的表达。方法 采用饥饿、疲劳、寒冷、惊吓等综合因素方法复制气虚血瘀证大鼠模型，观察大鼠胸主动脉血管内膜形态学，检测血管平滑肌细胞的凋亡指数及bcl2、bax蛋白的表达。结果 气虚血瘀大鼠血管内膜明显增殖，血管平滑肌细胞bcl2蛋白表达增高(96.15±0.02 vs 21.13±0.05);bax蛋白表达降低(1.05±0.12 vs 68.06±0.06);bcl2/bax增高(2.92±0.67 vs 0.01±0.01)(P<0.05)。结论 气虚血瘀证大鼠存在血管平滑肌细胞增殖和凋亡严重失调等病理生理基础。

【关键词】 气虚血瘀证;血管平滑肌细胞;细胞凋亡

　　【Abstract】 Objective To observe the apoptosis and the expression of of bcl2 and bax in the vascular smooth muscle cells of rats with qideficiency and blood stasis syndrome. Methods The rats model with qideficiency and blood stasis syndrome were induced by exertion， starvation， cold and high fat food. The morphology of the thoracic aorta intima was observed， and the apoptosis index (AI) and the expression of protein bcl2 and bax in the vascular smooth muscle cells were measured. Results The thoracic aorta intima apparently proliferated in model group (P<0.05)， the level of protein bcl2 in the vascular smooth muscle cells was significantly higher(96.15±0.02 vs 21.13±0.05， P<0.05) and the level of protein bax in the vascular smooth muscle cells was significantly lower than that of normal control group(1.05±0.12 vs 68.06±0.06， P<0.05). The ratio of bcl2 and bax was higher(2.92±0.67 vs 0.01±0.01， P<0.05). Conclusions There are pathological basis， such as the unbalance of the vascular smooth muscle cells proliferation and apoptosis in rats with qideficiency and blood stasis syndrome.

　　【Key words】 Qideficiency and blood stasis syndrome; Vascular smooth muscle cells;Apoptosis

　 气虚血瘀趋向是现代人群一个突出的体质病理学特征〔1〕，气虚血瘀证是临床多个学科、多种疾病常见中医证候之一，尤其在心脑血管疾病等老年慢性疾病中更为常见。 老年冠心病的病机关键是气虚血瘀，而主要病理变化在内皮功能失调(ED)〔2〕，ED同时也是动脉粥样硬化(AS)的启动步骤〔3〕。因此保护血管内皮细胞(VEC)，防治AS是防治心脑血管疾病的关键措施。本实验选用老龄大鼠，采用饥饿、疲劳、寒冷、惊吓等综合因素方法复制气虚血瘀证模型〔4～6〕，首次观察气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞的凋亡及bcl2、bax相关凋亡因子的表达，从细胞凋亡分子生物学角度探讨气虚血瘀的病理生理基础，为临床治疗心脑血疾管病等老年慢性疾病提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 SD大鼠24只，18月龄，雌雄各半(体重600～800 g)，由重庆医科大学动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK(渝)20070001。

　　1.2 主要仪器及试剂 DGB/20002A台式干燥箱(重庆实验设备厂)，HWS40B恒温水浴箱(江苏太仓市实验设备厂)，Lecia切片机(美国LECIA公司)，恒温冰箱(日本三洋公司)，HITACHI7500型透射电镜(上海玛登仪器有限公司)。bcl2及bax蛋白多克隆抗体、链霉卵白素过氧化物酶(SP)9001、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉生物技术公司)，细胞凋亡试剂盒(第三军医大学)，蛋白酶K(sigma公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 造模 空白对照组、造模组各12只，实验大鼠采用饥饿、疲劳、寒冷、惊恐刺激及高脂饮食4 w制作气虚血瘀证模型，方法：实验大鼠按每日40 g/kg体重提供饲料，每日上午8：00给予全日量的2/3，晚上20：00给予余下的1/3;每日放入10℃冷水中，以木棒追打强迫游泳直到疲劳;并将特制脂肪乳饮食按5 ml/kg加入实验大鼠饮水中。观察大鼠的体重、精神、舌质等，检测血流变学，其中模型组大鼠死亡2只。

　　1.3.2 标本采集及检测 耐疲劳时间：以游泳大鼠第一次自然下沉为度，测出开始游泳到捞出水面所用的时间。双球直管式检测。造模4 w后，将大鼠麻醉，取一段胸主动脉血管光镜下观察血管内膜、中膜情况。另取一段胸主动脉血管于透射电镜下观察。大鼠平滑肌细胞凋亡检测采用缺口末端原位标记法。bcl2、bax的检测：SP染色，按说明书所述方法进行，因标本取材不良，故各组标本数n=8。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS10.0软件包，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，采用SNK检验法。

　　2 结 果

　　2.1 气虚血瘀证大鼠模型鉴定 造模结束后，模型组大鼠不同程度出现倦怠嗜睡、精神萎顿、粪便稀溏、毛发干燥、舌质紫暗、眼球暗红等气虚血瘀症状。造模后大鼠体重(520.25±60.652) g较造模前体重(692.02±66.352) g明显减轻(P<0.05);模型组大鼠耐疲劳时间(4.45±1.54) min较空白对照组(8.89±2.09) min明显缩短(P<0.05);各项血液流变学指标较正常大鼠明显增高(P<0.01，P<0.05)，见表1。

　　2.2 大鼠血管平滑肌细胞凋亡及bcl2和bax表达 模型组大鼠血管平滑肌细胞凋亡指数(3.19±0.03) %较空白对照组(90.75±0.01) %明显下降，差异有统计学意义(P<0.05);模型组大鼠bcl2蛋白表达阳性率较空白对照组明显增高，bax蛋白表达阳性率明显降低，bcl2/bax比值明显增高(P<0.05)，见表2。

　　2.3 大鼠血管平滑肌细胞形态学改变 光镜下观察，空白对照组大鼠血管中膜平滑肌走行清晰，无增生，弹力纤维未见异常，无增厚。模型组大鼠血管内膜增厚，平滑肌与弹力纤维粗大，层数增多，排列致密.中膜向内膜过度增殖。见图1。电镜下观察，空白对照组VSMC可见具有凋亡特征的染色质边集。模型组VSMC核浆比例明显增大，细胞器不丰富，主要为幼稚血管平滑肌细胞。见图1。表1 空白对照组与模型组大鼠血液流变学指标表2 各组大鼠血管平滑肌细胞bcl2和bax表达

　　3 讨 论

　　中医认为，气为血帅，气行则血行，气虚则血瘀。本实验根据中医老年人气虚体质学说及“饥则损气”、“劳则耗气”、“湿伤脾、寒伤肾”、“忧思伤脾、惊恐伤肾”、“肥甘厚味伤脾”等病机学说，选用18月龄老龄大鼠，以饥饿、劳累、惊吓、寒冷、高脂等多因素复合法建立气虚血瘀证大鼠模型，符合中医气虚血瘀证病因病机特点。造模大鼠不同程度地出现气虚、血瘀相关体征，血黏度各项指标明显增高。说明本方法能成功复制气虚血瘀证大鼠模型。AS是一组以增生性为特征的血管病变，是心脑血管疾病的重要病理基础，防治AS是防治心脑血管病的根本措施。AS早期，血管平滑肌细胞的增殖与凋亡失衡造成了其数量的过度增加，最终导致血管壁逐渐增厚。据报道，74.4%的AS患者血管内膜及粥样斑块内存在平滑肌细胞凋亡失衡，造成血管平滑肌细胞数量的过度增加，最终导致血管壁逐渐增厚〔7，8〕。因而调整血管平滑肌细胞增殖与凋亡的平衡，维持血管壁细胞数目稳定在正常水平是治疗AS的重要途径。

　　B细胞淋巴瘤/白血病2基因(Bcl2基因)是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用，是凋亡分子机制研究的主要靶分子。目前已发现的Bcl2蛋白家族按功能可分为抗凋亡蛋白及促进凋亡蛋白〔9〕。Bcl2蛋白主要定位于线粒体外膜，拮抗促凋亡蛋白。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，或者开启线粒体的PT孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活半胱氨酶天冬氨酸酶，导致细胞凋亡〔10，11〕。本实验结果证实气虚血瘀证大鼠存在血管平滑肌细胞增殖和凋亡严重失调等病理生理基础，为临床应用补气活血法防治心脑血管疾病提供了病理生理实验依据。

参考文献

　1 邵致格，胡蔓青，王长松.现代人群的体质病理学特征：气虚血瘀〔J〕.医学与哲学，2005;26(4)：745.

　　2 刘 洪，李荣亨.气虚血瘀证与血管内皮细胞相关因子的研究进展〔J〕.中国中医基础医学杂志，2005;11(7)：5536.

　　3 Binder CJ，Chang MK，Shaw PX，et al.Innate and acquired immunity in atherogenesis〔J〕.Nat Med，2002;8(11):121826.

　　4 王 建，赵 辉，李 净，等.多因素复合制作气虚血瘀证脑缺血动物模型的实验研究〔J〕.中国实验动物学报，2001;9(4)：21620

　　5 李 净，王 建.益气活血法改善气虚血瘀证局灶性脑缺血再灌注模型鼠生物学特征的有效性评价〔J〕.中国中医基础医学杂志，2003;9(4)：225.

　　6 王 建，胡建鹏.缺血性中风气虚血瘀证动物模型的初步研究〔J〕.安徽中医学院学报，1999;18(2)：469.

　　7 Fukuo K，Hata S，Suhara T，et al.Nitric oxide induces upregulation of fas and apoptosis in vascular smooth musicle〔J〕.Hypertension，1996;27(32):8236.

　　8 Li PF，Dietz R，von Harsdorf R.Reactive oxygen species induce apoptosis of in vascular smooth muscle cell〔J〕.FEBS Lett，1997;404(23):2495.

　　9 Brown R.The bcl2 family of proteins〔J〕.Br Med Bulletin，1996;53(3):46677.

　　10 Rosse T，Olivier R，Monney L，et al.Bcl2 prolongs cell survival after Baxinduced release of cytochromec〔J〕.Nature，1998;391(6666):4969.

　　11 Zhivotovsky B，Orrenius S，Brustugun OT，et al.Injected cytochrome C induces apoptosis〔J〕.Nature，1998;391(6666):44950.