大鼠局灶性脑缺血Activin A及其受体ActRⅡA表达变化及意义

　　　　作者：莽靖 何金婷 李宗树1 胥桂华 郭洪亮 邵延坤 徐忠信

【摘要】 目的 探讨大鼠局灶性脑缺血激活素A(Act A)及其受体ⅡA(ActRⅡ)的表达变化规律及意义。方法 线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，采用光镜、免疫组化方法检测大鼠局灶性脑缺血后梗死体积、病理变化，免疫组化染色观察Act A、ActRⅡA免疫阳性表达。 结果 正常组织有极低水平的Act A、ActRⅡA表达，免疫组化显示缺血3 h后在周边区Act A、ActRⅡA阳性细胞数量显著高于假手术组(P<0.05)，并随缺血时间延长而逐渐增高，于24 h达高峰。结论 局灶脑缺血损伤可诱导内源性神经元Act A高表达，并可能通过特异性跨膜信号受体ActRⅡA发挥靶源性作用。

【关键词】 局灶脑缺血;激活素A;激活素受体

　　【Abstract】 Objective To investigate expression of Activin A and ActRⅡA in rat after focal cerebral ischemia.Methods Focal cerebral ischemia was induced by permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO) in the rat，injury and infarction volume in brain tissue were observed by HE stain，Activin A and ActRⅡA protein expression was measured by immunohistochemistry.Results Activin A and ActRⅡA protein expressed at a very low level in sham operation group，a strong upregulation in cortical areas next to the infarct was detected 3 h after MCAO(P<0.05).Expression of Activin A and ActRⅡA increased in response to cerebral ischaemia and reached acme 24 h after MCAO.Conclusions The expression of Activin A and ActRⅡA is gradually increased after focal cerebral ischemia，which has probable protective effects on cerebral injury.

　　【Key words】 Focal cerebral ischemia;Activin A;ActRⅡA

　激活素A(Activin A，Act A)作为一种新近发现的内源性神经保护物质，正日益受到关注。ActA是转化生长因子β(TGFβ) 超家族的成员之一，是由βA亚基通过二硫键连接而成的二聚体结构细胞因子〔1，2〕，具有广泛的生物学功能，但其在缺血性脑损伤中的表达变化及作用机制尚不明确。本实验采用大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，对 Act A、ActRⅡA表达的动态变化规律进行了研究，探讨其在缺血性脑损伤中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 成年健康雄性Wistar大鼠24只，体重250～300 g，鼠龄3～4个月，吉林大学实验动物中心提供。随机分成假手术组(接受手术但不插入线栓)、MCAO模型组缺血3、6和24 h，每组各6只。

　　1.2 MCAO模型大鼠评价 采用神经功能缺损评分评估MCAO后大鼠的神经损伤状况。HE染色苍白，神经细胞消失，核固缩，神经纤维网空泡化组织为梗死区，每张切片用图像分析检测、计算梗死面积。将每个鼠脑标本的所有含梗死灶组织块的梗死体积相加，为梗死体积值。

　　1.3 免疫组织化学方法检测Act A、ActRⅡA表达 ①在模型建立后3、6、24 h，大鼠经10%水合氯醛深度麻醉后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH7.4)进行灌注固定。取以视交叉为中心相当于前联合连续脑片继续固定4～6 h，常规脱水、浸蜡、包埋。②采用SP法(Act A、ActRⅡA一抗、二抗及DAB试剂盒购自北京博奥森生物)。细胞浆、胞膜染成棕黄色为阳性细胞。③应用彩色病理图像分析系统分析切片。所有切片均在同一光强度及放大倍数下进行，每张切片选取3个200倍镜下视野，计数阳性细胞数，以单个标本为单位，取平均值。

　　1.4 统计学分析 数据以x±s表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠神经行为学评分及梗死体积测定 模型组麻醉清醒后出现左前或左前后肢瘫，提尾悬空时左前肢内收腕屈曲，头向左侧背侧方扭曲，运动中出现向左转圈现象。假手术组无神经损伤体征。各组未见死亡大鼠。缺血3 h模型组HE染色光镜观察可见明确梗死灶位于大脑中动脉供血区的皮质、皮质下白质和纹状体，随缺血时间延长梗死体积逐渐增大，24 h达最高值;假手术组未见明确梗死灶，见图1。

　　2.2 各组大鼠免疫组织化学染色结果 假手术组见极少Act A、ActRⅡA阳性细胞表达;模型组随缺血时间延长，大脑中动脉供血区皮质、皮质下白质及纹状体Act A、ActRⅡA表达阳性细胞数增加，梗死周边区更明显，缺血24 h达高峰(表1)，Act A表达以胞核为主，ActRⅡA以胞浆和胞膜为主(图2)。表1 各组大鼠不同时间点Act A和ActRⅡA表达阳性细胞数与假手术组比较：1)P<0.01;与缺血3 h模型组比较：2)P<0.05　

　　3 讨 论

　　缺血性脑血管病发病机制和有效防治方法一直是国内外研究的热点。在缺血性脑损伤之后，神经细胞会发生一系列复杂的病理及病理生理变化，其中一些对缺血性损伤具有保护作用。激活素A分子量约26 kD，在多种组织中广泛表达，具有广泛的生物学功能。其可调控生殖和胚胎发育过程、调节红细胞分化、参与病理炎症过程、促进损伤后的修复过程，并参与器官纤维化的形成等。已有研究表明激活素除参与生殖、内分泌及细胞生长分化的调节等活动外，还能保护多种离体及在体神经元免受损伤〔3，4〕。本研究结果显示缺血3 h MCAO模型组可见明确梗死灶，随缺血时间延长梗死体积逐渐增大，其神经评分也随之增高。Act A免疫组化显示正常脑组织仅表达极少量的Act A，随缺血时间延长，神经元Act A表达增加，以梗死周边区更为明显，在缺血24 h达高峰，证实局灶性脑缺血可诱导激活素A的表达升高，且随缺血时间的延长呈动态变化。

　　激活素A生物功能主要是通过跨膜信号传导完成，其跨膜受体主要有Ⅰ、Ⅱ型2种，活化素主要与Ⅱ型受体结合，再由活化Ⅱ型受体募集Ⅰ型受体，并将Ⅰ型受体GS区磷酸化而将其激活，活化Ⅰ型受体与下游底物相互作用，将信号传递下去〔1，2〕。为探讨Act A在局灶性脑缺血后表达变化及作用，本研究同时采用免疫组化对激活素A的Ⅱ型跨膜受体表达进行了检测，脑缺血后 ActRⅡA阳性细胞表达也以梗死周边区更为明显，随缺血时间延长， ActRⅡA表达与Act A表达趋于一致。表明在缺血性脑损伤之后神经元可出现ActRⅡA高表达。本研究结果提示缺血性脑损伤可诱导内源性神经元Act A表达增高，Act A作为一种新近发现神经保护物质，其可能通过吩神经元上特异性跨膜信号受体ActRⅡA发挥靶源性作用，对缺血性脑损伤起内源性保护作用，其确切机制尚待深入研究。

参考文献

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　　2 Kurisaki A，Inoue I，Kurisaki K，et al.Activin induces longlasting NmethylDaspartate receptor activation via scaffolding PDZ protein activin receptor interacting protein 1〔J〕.Neuroscience，2008;151(4):122535.

　　3 Mukerji SS，Katsman EA，Wilber C，et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice〔J〕.Cerebral Blood Flow Metab，2007;27(16):116172.

　　4 Tretter YP，Hertel M，Munz B，et al.Induction of activin A is essential for the neuroprotective action of basic fibroblast growth factor in vivo〔J〕.Nat Med，2000;6(7):8125.