脂易消对NASH大鼠肝组织LP mRNA的调控

　　　　　　作者：周岳君 陈玉翠 姚海清 王浩 王捷

【摘要】 　　［目的］观察脂易消对实验性NASH大鼠肝组织LP mRNA影响。［方法］采用高脂饮食制备NASH大鼠模型。大鼠分低、中、高剂量脂易消治疗组、易善复胶囊阳性对照组、生理盐水阴性对照组、正常对照组。酶法检测大鼠血清中肝功能ALT、AST水平；肝组织常规HE染色，观察肝细胞脂肪变性、炎症活动程度；采用RTPCR法检测大鼠肝脏中LPmRNA 的表达水平。［结果］脂易消各治疗组大鼠血清ALT、AST水平与模型组比较有显著性差异（P<0.01，P<0.05）；肝细胞炎症活动度皆有明显改善（P<0.05）；肝组织LP mRNA表达明显降低（P<0.01，P<0.05）；但与易善复组相比，各剂量治疗组则无显著性差异（P>0.05）。 ［结论］脂易消通过改善肝细胞炎症活动度，减轻肝组织损伤，同时降低肝组织LPmRNA表达水平，对高脂饮食诱发的NASH有治疗作用，其疗效与易善复相似。

【关键词】 脂易消；脂肪肝；非酒精性；大鼠；LP

　　Abstract：［Objective］To observe Zhiyixiao effect on experimental NASH rats liver tissue LP mRNA，and discuss its mechanism.［Method］Take highlipid diet to make NASH rats models，which were pided into low，middle and high dosage groups（1，2，3） of Zhiyixiao treatment，positive control group（4） of Yishanfu capsule，NS negative control group（5） and normal control group（6）.Take enzyme method to measure rats serum liver function ALT，AST，tissue routine HE dye；observe liver cells steatosis and inflammatory action；take RTPCR to test LP mRNA expression.［Result］Compared to model groups，the ALT，AST had marked difference，the liver cells inflammatory action was improved much，and the LP mRNA expression level was much lowered in groups1，2，3；compared to group 4，there’s no obvious difference among other groups.［Conclusion］Zhiyixiao，through improving liver cells inflammatory action，reduces liver tissue injury，meanwhile lowers LP mRNA expression level，has cure function to NASH induced by highlipid diet，which is similar to Yishanfu；its path of treating nonalcoholic fat hepatitis may be related with its reducing LP mRNA expression level.

　　Key words：Zhiyixiao；NASH；rats；LP

　　非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是遗传－环境－代谢应激相关因素所致，以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。其非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一重要的病理阶段［12］，发病率逐年增高。

　　脂易消作为长期临床实践中总结出来的治疗脂肪肝的有效方药，经长期临床观察和前期课题证实疗效确切［3］，其药物组成主要由枳壳、半夏、泽泻、决明子、荷叶、鼠麹草等组成。具有祛湿解毒、消痰散瘀、降脂抑脂之效，正切合非酒精性脂肪肝乃湿毒痰瘀的病机特点。

　　本研究采用高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型，通过低、中、高各剂量组脂易消对其进行干预，易善复胶囊作为阳性对照药物。经药物干预后观察各实验组大鼠肝脏组织病理学改变，同时运用RTPCR技术检测肝组织中瘦素（leptin，LP）mRNA的表达水平，探讨脂易消治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物

　　清洁级SD大鼠60只，雄性，体重（180±20）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，分笼喂养，自由饮水和进食，室温23℃，湿度50%，明暗各12h，预养1周后进入实验阶段。

　　1.1.2 实验药品

　　脂易消：半夏、枳壳、荷叶、鼠麹草、泽泻、决明子、丹参等生药材购自浙江省杭州市方回春堂，由浙江省中医院制剂室制备成流浸膏。易善复胶囊：（多烯磷脂酰胆碱胶囊）：北京万安特制药有限公司，批号：J20020028；生理盐水：浙江省医药有限公司新昌制药厂，批号：050803。

　　1.1.3 主要实验仪器

　　德国AP2801型冷台、HM335型轮式切片机、Primo台式高速冷冻离心机，日本Olympus光学显微镜、SHZ82恒温摇床，上海PYXDHS35×40型Techne PCR仪、7020型全自动生化分析仪，广东AP2802型包埋机、P230高效液相色谱仪等。

　　1.1.4 主要实验试剂

　　上海申能-德赛有限公司ALT、AST试剂；宝生物工程（大连）有限公司Oligo d（T）18试剂、TaqTM试剂、MMLV反转录酶；美国 Invitrogen 公司TRIzol；上海生物工程有限公司PCR Marker、PCR引物合成。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物模型的建立和分组

　　将大鼠随机分成N、B、C、D、E、F6组：即正常对照组（简称正常组）、低、中、高剂量脂易消治疗组（简称低、中、高剂量组）、易善复阳性对照组（简称易善复组）和生理盐水阴性对照组（简称模型组），每组10只。正常组予普通饲料喂养，其余予高脂饲料喂养（内含10%猪油、2%胆固醇、0.5%胆盐、5%蛋黄粉，82.5%普通饲料）喂养，造模12周后处死动物。

　　1.2.2 给药途径及剂量

　　实验剂量按照实验动物研究“等效剂量”的计算方法［10］（50kg体重人/200g体重大鼠转换系数r=0.021）计算等效，脂易消剂量。经计算确定剂量如下：

　　A组：正常对照组，等容量的生理盐水灌胃，1次/d；B组：模型对照组，等容量的生理盐水灌胃，1次/d；C组：阳性对照组，易善复混悬液按等效剂量69.2mg/（kg·d）灌胃；D组：脂易消低剂量干预组，脂易消用蒸馏水溶解，按等效剂量8g/kg·d灌胃；E组：脂易消中剂量干预组，脂易消用蒸馏水溶解，按等效剂量16g/（kg·d）灌胃；F组：脂易消高剂量干预组，脂易消用蒸馏水溶解，按等效剂量32g/（kg·d）灌胃。

　　1.2.3 标本采集与保存

　　12周末次给药后，当日晚上禁食不禁水12h，次日上午空腹用3%戊巴比妥钠溶液（1ml/kg）腹腔注射麻醉后，下腔静脉取血，分离血清，置于-20℃冰箱保存待用；迅速取出肝组织，称重，在肝右叶中部切取数块肝组织保存于液氮中以提取总RNA，并取右叶组织石蜡包埋后用于病理检查。

　　1.3 指标检测

　　1.3.1 血清肝功能检测

　　大鼠血清用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST），均按上海申能-德赛有限公司试剂盒说明进行。

　　1.3.2 肝组织病理学检测

　　取大鼠肝脏右叶肝组织，立即用10%中性磷酸缓冲液（Phosphate Buffer Solution，PBS，PH=7.0，以下同）福尔马林液中固定，固定过夜后，按1×1×0.2cm大小取材，标记后流水冲洗30min，梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡，常规石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4μm，予苏木素-伊红染色（HE染色）：观察肝组织炎症、细胞变性情况等一般病理改变。
　　
　　NASH病理学诊断标准参考《非酒精性脂肪性肝炎诊断指南》［4］实施。

　　1.3.3 RTPCR检测LP mRNA表达

　　1.3.3.1 总RNA提取

　　从-70℃冰箱中取出300mg肝组织，用液氮将组织研磨成粉末，并加入Trizol2ml研磨，转移研磨好的液体到无RNA酶和无DNA酶的1.5ml离心管中。然后加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，室温离心12000 r/min×5min；吸取上层水相溶液并转移至另一新鲜的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止5min，再次室温离心12000r/min×5min，弃上清，然后加入70%乙醇1ml洗涤并干燥，最后用0.05mlDEPC去离子水重新溶解RNA。提取的总RNA经紫外线分光光度计测定提取物的浓度，A260／A280比值在1.8～2.0之间。

　　1.3.3.2 合成相关引物

　　根据核苷酸序列用primer premier 5.0设计引物，提交上海生物工程有限公司进行合成，leptin mRNA引物序列如下：APN上游引物：5′-AGG GAG ACG CAG GTGT-3′下游引物：5′-CTG ATA CTG GTC GTA GGT GA -3′，扩增片段368bp。内参照β-actin上游引物：5′-ATG CCA TCC TGC GTC TG-3′下游引物：5′-ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACAT-3′，扩增片段578bp。

　　1.3.3.3 逆转录反应

　　用上述细胞中提取的总RNA在下述反应体系中逆转录成cDNA，该反应体系组成如下：5×Buffer5μl，oligd（dT）10pmol，dNTP（2.5mM）4μl，RNA酶抑制剂1μl，MMLV逆转录酶5U。以DEPC水补齐至25ul，轻轻混匀，室温放置10min后移入42℃恒温槽中。42℃保温1h进行逆转录反应。反应结束后在冰水中冷却2min。所得到的反应液即可用于PCR反应中作为逆转录反应液。

　　1.3.3.4 PCR反应

　　取上述逆转录反应产物于50μl反应体积中进行PCR反应。反应体积组成如下10×Reaction Buffer5μl、4种dNTP的混合物（每种2.5mM）2μl、TaqDNA多聚酶（3μ/μl）、逆转录反应液3μl、上、下游特异引物各1μl、去离子水35μl。先在94℃预变性5min，然后按下述条件循环30次，变性94℃30s、退火55℃30s、延伸72℃30s，最后72℃延伸5min。

　　1.3.3.5 PCR产物分析

　　PCR产物5μl经1%琼脂糖（含溴化乙锭溶液 0.5μ g/ml）凝胶电泳2h，另取3u1 Marker作为DNA片段大小的对照。凝胶电泳后，应用天能图像分析系统进行扫描，用BandScan分析，测定产物条带的吸光度值，以βactin为基准，做半定量分析，即LP mRNA的相对表达水平以LP /βactin值表示。

　　1.4 统计学处理

　　用SPSS9.0 for Windows软件进行统计分析。实验数据以平均值±标准差（x±s）表示。统计分析方法采用单因素方差分析（one way ANOVA），P<0.05为有统计学差异，P<0.01有显著统计学差异。

　　2 实验结果

　　2.1 一般状况观察

　　实验期间，正常组大鼠精力旺盛，活泼好动，饮食正常，毛发有光泽，粪便成形，体重增加缓慢；模型组大鼠体重较正常组增长较快，毛发油腻，粪便松软粘臭，不成形，实验初期活动尚可，后期大鼠活动减少，形体肥胖，动作慵懒；中药高剂量、中剂量组、低剂量及易善复组大鼠体重增加缓慢，状态较模型组好，但不及正常组。实验中各组均无动物死亡发生。
　　
　　从表1可见，各组大鼠初始体重没有显著性差异（P<0.05）；实验结束时模型组大鼠的体重较正常组明显增加（P<0.05）；易复善组和中药治疗组大鼠的体重较正常组有所增加，与模型组比较则有所降低，但无统计学差异（P>0.05）；中药中剂量组大鼠的体重与正常组比较无明显差异（P>0.05），显著低于模型组和易复善组，有统计学差异（P<0.05）；中药低剂量组大鼠的体重高于正常组和中药高剂量组（P<0.05），但与模型组和吡格列酮组比较，无显著性差异（P>0.05）。同时，模型组大鼠的肝指数较正常组明显增加（P<0.01）；易复善组大鼠的肝指数较正常组明显增加，但明显低于模型组，有统计学差异（P<0.01）；中药中剂量组大鼠的肝指数高于正常组，却低于模型组，有显著性差异（P<0.01），与易复善组比较则无统计学意义（P>0.05）。表1 各组大鼠体重和肝指数（略）
　
　　2.2 血清肝功能检测

　　模型组大鼠的血清ALT、AST水平较正常组明显增高（P<0.01）；脂易消各剂量组和易善复组大鼠的血清ALT、AST水平均显著低于模型组（P<0.05），而三组大鼠的血清ALT、AST水平与易善复组比无明显差异（P>0.05，表2）。 表2 各组血清肝功能ALT，AST变化（略）

　　2.3 肝组织病理学观察情况

　　2.3.1 常规HE染色光镜下观察 正常组 HE染色显示，大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞多为单核，肝板呈条索状，围绕中央静脉呈放射状排列，无脂肪变性及炎症细胞浸润，见图1。
　　
　　2.3.2 模型组

　　HE染色显示，大鼠肝组织可见弥漫性肝细胞脂肪变，细胞肿胀，胞浆疏松，存在大量脂肪空泡。汇管区和小叶间有炎症细胞浸润，正常的肝小叶结构被破坏，部分大鼠小叶内坏死灶融合成片，但未见肝纤维化形成；其肝组织脂肪变性程度与正常组相比有显著差（P<0.01）。见图2。

　　2.3.3 脂易消各剂量组

　　HE染色显示，大鼠肝组织可见弥漫性肝细胞脂肪变，程度较模型组略轻，但无统计学意义（P>0.05）。汇管区和小叶间有少量炎症细胞浸润；其炎症积分明显低于模型组（P<0.01）。见图3～4。表3 各组大鼠肝脂肪变性程度（略）表4 各组大鼠肝组织炎症活动度（略）

　　2.3.4 易善复组

　　基本与脂易消各剂量治疗组相近，其炎症积分与脂易消各剂量组相比无明显差异（P>0.05）。见图5。

　　2.4 肝组织leptin mRNA表达水平检测

　　模型组大鼠肝脏中LP mRNA表达的水平较正常组显著升高（P<0.01），易复善组较正常组升高明显（P<0.05），较模型组显著降低（P<0.01）；脂易消各治疗组较正常组升高明显（P<0.05），较模型组显著降低（P<0.01）；而较易善复组无明显差异（P>0.05）。见图6。表5 脂易消对大鼠肝脏中LP mRNA表达的影响（略）

　　3 分析与讨论

　　NASH是NAFLD的中间病理阶段，是在单纯性脂肪肝的基础上的进一步发展，其主要病理表现为明显的肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润。LP是肥胖基因产物，由白色脂肪细胞所分泌，可控制食物摄取和能量消耗，调节脂肪代谢，使体脂保持相对稳定。如血清中LP水平升高，可通过促进胰岛素分泌而引起胰岛素抵抗，使外周脂肪分解，血中游离脂肪酸增加，促进脂肪酸在肝内蕴积引起脂肪肝。有研究表明，脂肪肝患者血清LP水平显著高于对照组，而且与转氨酶的升高平行，并经多元回归分析表明，LP是脂肪肝发生的独立危险因素，又与体脂、体重指数（BMI）等呈正相关，也是一个测定人体脂肪量很好的血液指标［5］。

　　评价NASH疗效的金标准是肝脏组织病理学检查。本实验发现，正常组大鼠肝组织无明显异常；模型组大鼠肝组织可见弥漫性肝细胞脂肪变，程度均为重度，伴小叶内炎症及汇管区有炎细胞浸润，部分大鼠小叶内坏死灶融合成片，但未见肝纤维化形成。脂易消各治疗组大鼠肝组织也见重度脂肪变性，与模型组比差异无显著性（P>0.05）；肝组织的炎症分布和性质与模型组相似，但程度明显减轻；其炎症活动度较模型组显著下降（P<0.05），但仍高于正常对照组（P<0.05）；与易善复组相似（P>0.05）结果显示模型组大鼠脂肪变性处F3级，结果符合国内多数文献的报道；脂易消各剂量组能明显改善肝组织炎症活动度，均与易善复组相似（P>0.05），说明脂易消能减轻NASH大鼠炎性反应。同时研究结果显示，脂易消各剂量组大鼠肝组织LPmRNA的表达水平较模型组显著降低。本实验提示脂易消可减轻肝组织炎症损伤，具有治疗作用，疗效与易善复相似；能显著降低NASH大鼠肝组织LP mRNA表达水平，提示其治疗NASH作用机理可能与其降低LP mRNA在肝脏的表达有关。

参考文献

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　　［3］周岳君，姚海清.脂易消治疗非酒精性脂肪肝36例疗效观察［J］.浙江中医学院学报，2005，29（6）：1819.

　　［4］中华医学会肝脏学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2006年2 月修订）［J］.肝脏，2006，11（1）：6870.

　　［5］周红文，刘超，陈家伟，等.脂肪组织的内分泌功能［J］.国外医学.内分泌分册，2002，22（1）：3436.