尿多酸肽（CDA2）诱导多发性骨髓瘤细胞RPMI8226凋亡的实验研究

　　　　 作者：叶宝东 沈一平 周郁鸿 邵科钉 俞庆宏

【摘要】 　　［目的］观察尿多酸肽（CDA2）对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226抑制增殖和凋亡作用。［方法］应用MTT法，检测CDA2对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖的影响。通过Hochest33258染色、流式细胞仪（Annexin V和PI双染色）检测细胞凋亡。［结果］CDA2明显抑制RPM18226细胞的增殖。CDA2作用RPM18226细胞增殖24h的半数抑制浓度（IC50）分别为1.64mg/g。采用Hochest33258染色，荧光显微镜下观察CDA2以2mg/g及4mg/g终浓度作用于RPM18226 24h后细胞形态改变，可见明显的凋亡小体出现。Annexin VPI双标记法流式细胞仪分析结果显示，RPMI8226细胞2mg/gCDA2作用6、12、24h后，早期凋亡细胞百分数分别为5.43%、12.02%、29.07%，明显高于空白对照组4.88%。［结论］CDA2对MM细胞株RPMI8226有生长抑制作用，可能是通过诱导其发生凋亡而起作用。

【关键词】 多发性骨髓瘤；尿多酸肽；细胞凋亡

　　Abstract：［Objective］To investigate the proliferation inhibition and apoptosisinducing effect of uroacitides（CDA2）on human multiple myeloma RPMI8226 cells.［Methods］MTT assay was undertaken to observe the growth inhibition of RPMI8226 cells exposed to CDA2.The apoptosis of RPMI8226 cells were detected by fluorescence staining with hochest33258，flow cytometry（Annexin V and PI staining）.［Results］MTT analysis indicated that the proliferation of RPMI8226 cells were inhibited significantly with CDA2 treatment for 24h.Treatment with different concentrations of CDA2 for 24h，50% growth inhibition（IC50）at 24h in RPMI8226 was 1.64mg/g.Cell appearances were observed by fluorescence staining with hochest33258 after CDA2（2mg/g and 4mg/g）for RPMI8226，we could see apoptotic body evidently with fluorescence microscope.After treatment with concentrations of CDA2（2mg/g）for 6h，12h，24h，RPMI8226 had 5.43%，12.02% and 29.07% apoptotic cells，which was more than that of untreated group（4.88%）.［Conclusions］Uroacitides（CDA2）could inhibit the proliferation and induce apoptosis of human multiple myeloma RPMI8226 cells in vitro.

　　Key words：multiple myeloma；CDA2；cell apoptosis

　　尿多酸肽（CDA2）是从健康人尿中提取的含有多种有机酸和多肽成分的非细胞毒性新型诱导分化治疗抗癌药［1］。近年来的研究表明，CDA2对多种肿瘤细胞具有诱导分化和凋亡作用，而且还可以逆转肿瘤耐药，防止肿瘤复发和转移［2］。但对多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）的作用尚未见报道，我们观察了CDA2对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖抑制的作用，并初步从诱导凋亡角度探讨其作用机制，为临床应用CDA2治疗提供多发性骨髓瘤实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞株

　　人多发性骨髓瘤细胞株：RPM18226（浙江大学第一附属医院血液研究所惠赠）。

　　1.2 主要试剂及药品

　　CDA2由台湾信东化学工业公司廖明徵博士馈赠（原药，药物浓度为278mg/ml），实验前用RPMI1640培养液稀释成所需浓度。RPMI1640，胎牛血清（FBS）：GIBCO公司；四甲基偶氮哇蓝（3（4，5dimethylthiazol2yl）2，5diphemyltetrazolium Bromide，MTT）：Sigma公司；Hochest33258染料：美国BD公司；PI试剂盒：Sigma公司，4℃保存；Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒：美国CALTAG公司。

　　1.3 RPMI8226细胞株的培养

　　多发性骨髓瘤细胞RPMI8226用含体积分数为10%热灭活小牛血清（56℃，灭活30min）的RPMI 1640培养基，置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中常规培养。每2～4d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

　　1.4 MTT比色法检测细胞增殖

　　取对数生长期细胞，新鲜培养液洗涤后，重悬于含体积分数为10%FBS的RPMI1640培养液中，以5×105个细胞/ml接种于96孔培养板，加入不同浓度药物，空自对照组以无血清RPMI1640补足，每孔总体系0.2m1，分别处理24、48h，加MTT工作液20μl/孔（终浓度0.5mg/ml），置37℃，体积分数为5%CO2培养箱中孵育4h，1000rpm/min离心，小心吸去上清，加入二甲亚砜0.2ml/孔，振荡仪上震荡。在酶标仪570nm波长处读取吸光度值（A）。半数抑制浓度（IC50）采用Logit法计算。实验重复3次，设复孔3个，取平均值为最终结果。
叶宝东，等: 尿多酸肽（CDA2）诱导多发性骨髓瘤细胞RPMI8226凋亡的实验研究

　　1.5 细胞形态观察

　　CDA2以2mg/g及4mg/g终浓度作用于RPM18226细胞24h后，收集空白对照及药物处理细胞，PBS洗涤2次。用1μlHoechst33258（1mg/ml）孵育100μl样品细胞（8×105/ml）10min，样品作细胞甩片，空气干燥后加盖玻片，Zeiss荧光显微镜（×200）观察。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

　　参照Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。细胞以5×105/ml接种6孔培养板，分别加入CDA2实验浓度为2mg/g作用RPMI8226，同时设空白对照组，6、12、24h后收获细胞，收集1×106个细胞，冷PBS洗涤2次，1000 rpm/min离心，4℃7min，弃上清。将细胞重悬于1ml 1×Binding buffer，取100μl细胞置于流式细胞仪专用试管中，加5μl Annexin VFITC和5μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15min，加入300μl 1×Binding buffer，立即用流式细胞仪检测，Cellquest 1.2分析软件分析结果。

　　1.7 统计分析方法

　　常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差（means±sd）表示。多组资料之间的比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差别有统计学意义。采用SPSS15.0 for Windows统计处理软件分析。

　　2 结果

　　2.1 CDA2对RPMI8226细胞的生长抑制作用

　　不同浓度的CDA2（0～4mg/g）处理RPMI8226细胞24h，与空白组比较，各药物处理组具有显著的生长抑制作用（P<0.05）；其在24h的半数抑制浓度（IC50）为1.64mg/g。CDA2对RPMI8226细胞的抑制作用有剂量依赖关系，见表1、图1。表1 CDA2对RPMI8226细胞生长的影响（MTT法）（N＝3）

　　2.2 Hochest33258荧光染色观察CDA2对RPMI8226细胞株作用

　　取2mg/gCDA2作用于RPMI8226 24h后，Hochest33258荧光染色后，细胞甩片，Zeiss荧光显微镜（×200）观察细胞形态，可见凋亡细胞的形态学特征：细胞核浓集及出现凋亡小体。

　　2.3 CDA2诱导RPMI8226细胞株PS转位

　　Annexin VFITC及PI双标记细胞后流式细胞仪检测结果显示，用相同浓度梯度的CDA2（2mg/g）作用RPMI8226细胞6、12、24h，RPMI8226细胞的早期凋亡细胞百分数在空白对照组为4.88%，药物处理6、12、24h组分别为5.43%、12.02%、29.07%。可以见到晚期凋亡细胞（AnnexinV＋PI＋）也呈时间依赖性增加，在药物作用24h时尤为明显。

　　3 讨论

　　1979年，廖明徵等发现多种癌细胞中存在异常的甲基转移复合酶，人尿提取物可以诱导HL60细胞向成熟细胞分化，与其抑制异常的甲基转移复合酶活性有关，并将其命名为CDA2（cell differentiation agent，细胞分化剂）［1］。研究发现，CDA2中含有人体中存在的多种有机酸和小分子多肽，这些成分协同作用，诱导癌细胞向成熟细胞分化，所以CDA2的化学名又称尿多酸肽（Uroacitides）。临床前研究表明，CDA2对于人T细胞淋巴癌细胞H9、人乳腺癌细胞MDAMB231和MCF7、人肝癌细胞Bel7402和HepG2及人急性早幼粒白血病细胞HL60等具有诱导凋亡的作用，也有研究表明CDA2能够逆转肿瘤耐药、防止肿瘤复发与转移［3］。
　　
　　多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）的治疗方法包括常规化疗，造血干细胞移植（PBSC）［4］。但目前来说，其仍是难以治愈的血液系统恶性疾病。近几年MM的发病率有上升趋势，发病年龄趋于年轻化。从天然药物中寻找高效、低毒的抗肿瘤细胞制剂是当前的研究热点之一。CDA2作用于MM的研究目前尚无报道。我们首先观察了CDA2对MM细胞增殖的影响，结果显示，CDA2对MM细胞株RPMI8226有明显的增殖抑制作用，并呈时间和浓度依赖关系，24h IC50分别为1.64mg/g。为探讨CDA2可能的作用机制，我们通过Hochest33258荧光染色观察到CDA2对RPMI8226细胞株有诱导凋亡的作用，Zeiss荧光显微镜下可见凋亡细胞的形态学特征，细胞核浓集及出现凋亡小体。并通过流式细胞术进一步证实，CDA2诱导有RPMI8226细胞株PS转位现象。但CDA2诱导RPMI8226细胞凋亡的具体机制不是很清楚，仍需进一步的研究。

参考文献

　　［1］廖明徵.聪明的抗癌药CDAII［M］.中国台北：世茂出版社，1999：139213.

　　［2］Agadir A，Chen Gq，Bost F，et al.Differential effect of retinoic acid on gowth regulation by phorbol ester in human cancer lines［J］.Biol Chem，1999，274：19779 29785.

　　［3］Masood R，McGarvey ME，Zheng T，et al.Atineoplastic urinary protein inhibits Kaposi’s sarcoma and angiogenesis in vitro and in vivo［J］.Blood，1999，93：103844.

　　［4］Facon T，Mary J，Harousseau J，et al.Superiority of melphalanprednisone（MP）+ thalidomide（THAL）over MP and autologous stem cell transplantation in the treatment of newly diagnosed elderly patients with multiple myeloma［J］.J Clin Oncol，2006，24：1s，Abstract 1.