针药合用刺激嗅觉系统对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马自由基系统的影响

　　　　作者：牛文民 刘智斌 杨晓航 牛晓梅 王渊

【摘要】 　　［目的］探讨针药合用刺激嗅觉系统对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马自由基系统的影响作用。［方法］成年SD雄性大鼠48只，体重（300±10）g。随机分为正常对照组、VD模型组、VD嗅球损毁模型组、嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用组，每组8只。制作VD大鼠模型和VD并损毁嗅球大鼠模型，分别通过嗅三针电刺激、丁香酚刺激、针药合用方法，测试大鼠水迷宫学习记忆能力并测定海马MDA含量、GSHPx和SOD活性。［结果］定位航行试验显示，平均逃避潜伏期和平均游泳路程比较，正常对照组明显短于VD模型组（P<0.01）；嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用组均明显短于VD模型组（P<0.01）；针药合用组短于嗅三针组、丁香酚刺激组（P<0.05）；嗅三针组与丁香酚刺激组相比较，其差异无显著性意义（P>0.05）；VD模型组与VD嗅球损毁模型组相比较，其差异无显著性意义（P>0.05）。海马自由基系统检测显示：与正常对照组比较，VD模型组海马MDA含量显著增高（P<0.01），而海马GSHPx和SOD活性明显降低（P<0.01）；与VD模型组比较，嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用组海马MDA含量显著降低（P<0.01），而海马GSHPx和SOD活性显著增高（P<0.01）；针药合用组与嗅三针组、丁香酚刺激组比较，海马MDA含量降低（P<0.05）。［结论］嗅三针和丁香酚均能够显著增强VD大鼠学习记忆功能、能降低海马MDA的含量、并且提高海马GSHPx和SOD的活。

【关键词】 针药

　　Abstract：［Objective］To explore the effect of combined acupuncture and medicine on learningmemory abilities，and free radical system of hippocampus in vascular dementia（VD）rats.［Methods］The 48 Sprague Dawley rats were randomly pided into control（1），VD model（2），VD plus removed olfactory bulb model（3）and XIU Three Needles（4），Eugenol（5），combined acupuncture and medicine（6）groups.Morris maze tests were conducted for valuating the learning and memory abilities.The contents of MDA，SOD and GSHPx activity of hippocampus were detected.［Results］In comparison with group 1，the average escape latency and travel distance prolonged significantly in group 2.In comparison with group 2，it shortened remarkably in groups 4 and 5.No significant differences were found between groups 1 and 2.In comparison with group 6，it prolonged in groups 4 and 5.No significant differences were found between them.The MDA content of hippocampus in VD model group was higher than that of control group（P<0.05）；The SOD and GSHPx activity group 2 were lower than group 1；the MDA in group 2 was higher than that of groups 4 and 5；The SOD and GSHPx activity of hippocampus in VD model group were lower than those of groups 4 and 5.No significant differences were found between groups 2 and 3.The MDA in group 6 was lower than that of groups 4 and 5；the SOD and GSHPx activity in group 6 were higher than groups 4 and 5.No significant differences were found between groups 4 and 5.［Conclusion］The XIU Three Needles and Eugenol increased the learningmemory abilities of VD rats，decreased MDA，and increased SOD and GSHPx activity of hippocampus.

　　Key words：vascular dementia；olfactory；learningmemory；MDA；SOD；GSHPx；XIU Three Needles；Eugenol；combined acupuncture and medicine

　　血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是由脑血管疾病因素导致脑组织损害而引起的痴呆综合征。研究表明，自由基的过氧化损伤是VD的主要病理机制之一［1］。笔者依据多年来治疗VD的经验［24］，选择血管性痴呆大鼠作为对象，探讨针药合用刺激嗅觉系统对VD大鼠学习记忆能力及海马自由基系统的影响作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物及分组

　　成年Sprague Dawley雄性大鼠48只，体重(300±10)g，由第四军医大学实验动物中心提供。实验动物随机分为正常对照组、VD模型组、VD嗅球损毁模型组、嗅三针组、丁香酚刺激组、和针药合用组，每组8只。

　　1.2 主要仪器

　　SDQ30双极射频电凝器（上海手术器械厂出品）；Morris水迷宫实验系统，（北京现代太极电子有限公司出品）；722型光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂出品）。

　　1.3 大鼠模型制作

　　1.3.1 VD大鼠模型制作

　　按照经典的四血管阻断（4—Vesselocclusion，4VO）方法制作血管性痴呆模型［5］。用10%水合氯醛（0.4ml/100g体重）腹腔注射麻醉大鼠，常规无菌操作。颈部背侧后正中切口，暴露第一颈椎横突孔，电凝烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24h后，颈部腹侧前正中切口，分离双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h。手术部位施以适量青霉素抗感染，仔细缝合，常规饲养。

　　1.3.2 VD损毁嗅球大鼠模型制作

　　参照陈志蓉报道的损毁大鼠嗅球的方法［6］，将VD造模成功的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立体定位仪上。在大鼠颅顶正中切开皮肤，小范围分离暴露前囟。在大鼠颅顶正中线位于前囟前面5mm两侧旁开2mm处，分别钻两个直径为1mm的小孔。将HS—80型电烙铁的烙头插入颅内，电凝损毁双侧嗅球。嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用组大鼠均制作VD模型。

　　1.4 实验方法 实验时间为45d。

　　1.4.1 嗅三针组

　　嗅三针穴定位：两侧迎香及印堂穴。依据李忠仁教授主编的《实验针灸学》动物选穴标准［7］，“迎香”穴：大鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处；“印堂”穴：大鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点。操作：选用“华佗牌”不锈钢针，30号0.5寸毫针。迎香穴向内上方斜刺0.3cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3cm；电针仪：G6805电针仪，上海医疗仪器厂出品；刺激参数：疏密波，频率80～100Hz，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度（电流强度：13mA，电压：13V）。时间：留针10min，持续电刺激，1次/d。5d为1个疗程，休息2d，共进行6个疗程。

　　1.4.2 丁香酚刺激组

　　操作：制作1个仅留有2个小通气孔的实验盒，在实验盒底部铺1薄层药棉，将丁香酚溶剂均匀地喷洒在药棉上，在其上放置1个金属网架。待药味充分弥散在整个实验盒时，将实验动物放在金属网架上，然后加盖封闭。10min后，将实验动物取出。1次/d，5日为1个疗程，休息2d，共进行6个疗程。丁香酚试剂购自江西樟树市本草天然药用油厂，纯度99%。

　　1.4.3 针药合用组

　　先行嗅三针刺激再行丁香酚刺激。

　　1.4.4 VD嗅球损毁模型组

　　同针药合用组

　　1.4.5 正常对照组及VD模型组

　　1次/d采取与以上3组相同的捉拿固定，但不施加任何干预措施。

　　1.5 检测指标

　　1.5.1 Morris水迷宫定位航行试验［8］：治疗结束后，开始水迷宫测试。水迷宫内水深41cm，水温22℃～26℃。在水池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，任选一象限正中放置平台，没于水下1cm，水面覆盖塑料泡沫。将受试大鼠按顺时针方向依次由E、S、W、N4个入水点顺序面向池壁放入水中。记录2min内寻找平台的时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在2min内找到平台，记录其实际逃避潜伏期及游泳路程；如果大鼠在2min内未找到平台，由测试者将其引上平台并停留10s，逃避潜伏期记录为2min。历时6d，1次/d。用6d找到平台的平均逃避潜伏期和平均游泳路程评价动物的学习记忆能力。

　　1.5.2 海马自由基系统测定；大鼠断头后快速取出全脑，置于冰盘上分离海马，称重后加入预冷生理盐水，制成10%的脑匀浆，4℃离心（3000r/min，20min），取上清液置于—80℃冰箱内保存待检测。海马MDA含量测定采用硫代巴比妥酸钠（TBA）比色分析法；海马GSHPx活性测定采用二硫代二硝基甲苯酸法（DTNB）；SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法。三项指标测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究院，按照药盒说明书操作。

　　1.6 统计方法

　　采用SPSS12.0软件，实验数据用x±s表示，采用单因素方差分析、组间均值进行t检验。

　　2 结果

　　2.1 Morris水迷宫定位航行试验结果 见表1。表1 各组大鼠Morris水迷宫定位航行试验结果比较（略）
　　
　　2.2 各组大鼠海马MDA含量及GSHPx、SOD活性的比较结果显示 见表2。表2 各组大鼠海马MDA含量及GSHPx、SOD活性的比较（略）

　　3 讨论

　　血管性痴呆（VD）属于中医“善忘”、“呆病”、“痴证”等范畴。依据现代医学理论，VD是由于心脑血管病变，因缺血性或出血性脑组织损害所导致的认知功能障碍，是老年痴呆的常见类型。国内外有关脑血管疾病的临床及实验研究发现，自由基的过氧化损伤是VD主要病理机制之一［1］。

　　现有的研究结果表明，自由基是VD脑缺血后神经细胞损伤的主要因素。自由基对学习记忆有明显的损伤作用，它对智力的损害主要表现为对细胞膜上不饱和脂肪酸的破坏和过氧化以及MDA的产生。MDA是一种大分子交联剂，它能交联蛋白质和核酸，直接影响生物信息的传递、转录和复制，表现为记忆及智力下降。SOD和GSHPx均为机体内重要的抗氧化金属酶类，它们作为机体内在抗氧化体系，能够直接清除自由基，免除其过氧化损伤［9］。
　　
　　本研究结果显示，嗅三针和丁香酚均能够明显增强VD模型大鼠学习记忆能力，并且能提高VD模型大鼠海马SOD和GSHPx活性同时降低MDA的含量。然而，对于VD损毁嗅球模型大鼠，嗅三针和丁香酚均未能增强其学习记忆能力也没有明显影响海马SOD、GSHPx活性及MDA的含量。这表明嗅三针和丁香酚均对于VD大鼠的疗效是通过嗅觉传导路对中枢神经系统产生作用的，这恰好与笔者先前的研究结果相一致［2］。
　　
　　本研究证实了嗅三针和丁香酚均对VD具有确切的治疗作用，其作用机理与调节海马自由基系统密切相关，针药合用效果更显，其疗效的发挥有赖于嗅觉传导路的完整性。

参考文献

　　［1］牛文民，李忠仁.缺血性脑血管病的自由基损伤病原学及抗氧化治疗的研究进展［J］.上海针灸杂志，2005，24（1）：4345.

　　［2］刘智斌，牛文民，杨晓航，等.嗅三针治疗血管性痴呆的随机对照研究［J］.针刺研究，2008，33（2）：131134.

　　［3］Niu Wenmin.Clinical study on treatment of Vascular Dementia with Scalp Acupuncture.［J］J Acupuncture and Tuina，2008，6（1）：2425.

　　［4］刘智斌，牛文民，杨晓航，等.头部发际区排针法治疗血管性痴呆疗效观察［J］.中国针灸，2007，27（6）：412414.
　　
　　［5］赖新生，王黎，江雪华.电针对实验性血管性痴呆大鼠学习记忆及SOD和MDA的影响［J］.中国针灸，2000，20（8）：497500.

　　［6］陈志蓉.贯叶连翘提取物对大鼠双侧嗅球损毁模型的行为学影响［J］.中国药学杂志，2004，39（9）：663666.

　　［7］李忠仁.实验针灸学［M］.北京：中国中医药出版社，2004：327329.

　　［8］Morris R G.Place navigation impared in rats with hippocampal lessens［J］.Nature，1982，297（5868）：681682.

　　［9］Schmidley J W.Free radicals in central nervous system ischemia［J］.Stroke，1990，21（7）：10861090.