H22小鼠肝癌细胞接种数与实验性肺转移的相关性

【摘要】 目的：探讨h32小鼠肝癌细胞接种数与实验性肺转移的相关性。方法：昆明种小鼠尾静脉注射不同数量(1×107、7.5×106、5×106、2.5×106、1×106)h32细胞制作实验性肺转移模型，肉眼及镜下观察肺内肿瘤的有无、大小、转移程度及分布情况，血清ICAM1、IL2蛋白的表达情况。结果：接种1×107细胞浓度组小鼠肺转移率、恶化程度及血清中ICAM1蛋白表达的量均高于其他接种组(P<0.01)，IL2蛋白表达低于其他接种组(P<0.01)，其中部分小鼠有脑转移。结论：小鼠实验性肺转移的发生率、转移程度及血清中ICAM1、IL2蛋白的表达量与细胞接种数变化密切相关。

【关键词】 肝癌;ICAM1;IL2;实验性肺转移

　　Abstract：[Objective]To study correlation cell number of mouse h32 liver carcinoma with occurrence of the experimental pulmonary metastasis.[Method]The Kunming mouse experimental pulmonary metastatic model of different h32 liver carcinoma cell numbers was established by injecting tail vein;distribution，size and grade of metastatic nodes were observed by naked eye and microscope，expressing of ICAM1 and IL2 in blood serum of mouse was detected.[Result]Rate and grade of pulmonary metastasis and expressing of ICAM1 in blood serum were higher for mouse of injecting1×107 cell number than other groups，and lower for expressing of IL2 in blood serum obviously，some had brain metastases among these mice.[Conclusion]The rate and grade of mice experimental pulmonary metastasis and expressing of ICAM1，IL2 are correlated with cell number.

　　Key words： hepatoma;ICAM1;IL2;experimental pulmonary metastasis

　　大量证据表明原发肿瘤早期阶段有恶性肿瘤细胞脱落到循环系统[1]，这些脱落的恶性肿瘤细胞可导致肿瘤复发和转移，外周血循环肿瘤细胞是一个恶性肿瘤扩散的表现，对这些肿瘤细胞的检测可以帮助对肿瘤转移特征的认识及帮助改善肿瘤分期、判断预后、指导治疗、监测治疗效果。由此本实验探讨外周血循环h32细胞数与实验性肺转移的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 鼠白介素2(IL2)定量ELISA试剂盒(美国 Biosource 公司)，鼠细胞间黏附分子1(ICAM1)定量ELISA试剂盒(美国 R&D systems 公司);小鼠肝癌h32腹水型细胞株由长海医院中医科实验室提供。

　　1.2 实验动物 昆明种小鼠，(20±2)g，雌雄各半，共100只。由复旦大学实验动物中心提供。许可证号：SCXK沪20020002。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 小鼠肝癌h32细胞腹水瘤模型的建立 收集指数生长期的小鼠肝癌h32细胞，调细胞浓度为2×107/ml，取健康雄性昆明种小鼠5只，无菌条件下每只腹腔接种细胞悬液0.2 m1，5～7天成腹水瘤模型。

　　1.3.2 小鼠肝癌h32细胞接种数对实验性肺转移率及转移程度的影响 将小鼠随机分成5组，每组20只，雌雄各半。取指数生长期乳白色小鼠肝癌h32腹水瘤细胞，台盼蓝染色，显微镜下观察细胞存活率>95%，常规细胞计数，用生理盐水依次调整浓度为：5×107/ml、3.75×107/ml、2.5×107/ml、1.25×107/ml、5×106/ml。取上述细胞悬液，给予小鼠尾静脉注射，0.2 ml/只。2W后取血脱颈处死全部小鼠，取全肺，用Bouin氏液固定24 h，然后用无水乙醇漂洗至黄色褪去，转移灶呈白色小点，用肉眼观察肺内肿瘤的有无、大小及分布情况，同时观察心、肝、脑、肾、脾、胸腺、肌肉、骨骼组织肿瘤分布情况，并取标本，10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，苏木素伊红染色，光镜下观察肿瘤组织分布、大小。肺内肿瘤转移程度参照文献[2]进行分级：大体观察分级：Ⅰ级，单个小的转移灶1～5个(直径均在1mm以下);Ⅱ级，小的转移灶在肺内弥散分布，6～10个或单个中等转移灶(直径在1～2mm之间);Ⅲ级，小的转移灶呈广泛分布(几乎所有肺叶)，或存在几个大的转移灶(直径在2mm以上)。②肺内转移瘤的组织学分级：Ⅰ级，在显微镜下见1～5个小转移灶，灶内偶见核分裂相;Ⅱ级，肺内有5～10个小转移灶;Ⅲ级，肺内广泛分布的小转移灶10个以上。③淋巴结内瘤组织分级：Ⅰ级，淋巴结内的边缘窦内有成堆的癌细胞，形成小的转移灶;Ⅱ级，在淋巴结的边缘窦及中间窦内已形成明显的转移灶。Ⅲ级，淋巴结的大部分由癌细胞所充满，转移灶内常见坏死。

　　1.3.2 小鼠血清ICAM1、IL2蛋白表达 方法同1.3.1，接种2周后眼眶取血，离心后取血清，采用酶标免疫法检测小鼠血清ICAM1、IL2的表达，按照试剂盒操作说明书进行。

　　1.4 统计学处理 应用 SPSS for Windows 11.0软件进行统计，结果表示x±s。计量资料经正态性检验和方差齐性检验后，多组间比较采用方差分析;计数资料比较采用x2检验。

　　2 结果

　　2.1 h32细胞接种数对实验性肺转移率及转移程度的影响 在实验性肺转移模型中，随h32肿瘤细胞接种数的增加，小鼠实验性肺转移率随之增加，肺转移程度也随之逐渐加大即小鼠肝癌h32细胞接种数与肺转移率、肺转移程度呈正相关性，见表1。表1 不同细胞接种数对小鼠肺转移率及转移程度的影响

　　2.2 h32细胞接种数对血清ICAM1、IL2蛋白表达的影响 在实验性肺转移模型中，当h32肿瘤细胞接种数的增加，小鼠血清ICAM1表达的量随之增加，而IL2表达的量随之减小，见表2。表2 接种不同细胞数对小鼠血清ICAM1、IL2表达的影响

　　3 讨论

　　目前，原发性肝癌的发生率逐渐上升，肝细胞癌已排在世界肿瘤患者死亡率的第3位[3]，对于原发性肝癌患者手术切除仍是治疗的首选方法[4]。近年来，研究表明实体瘤(如肝癌)患者的外周血中存在一定数量的肿瘤细胞，即使手术切除后和相对局限的病灶亦不例外[5]。曾有研究手术、放疗、化疗反而会加速肿瘤细胞在外周血中的播散[6]。在此研究基础上，拟假设恶性肿瘤的发生、发展和转移和外周血中的肿瘤细胞数有一定的关系。本实验就此研究了小鼠实验性肺转移和接种到外周血循环h32肝癌细胞数的关系。研究结果表明：外周血中接种的肿瘤细胞数与肿瘤转移呈正相关。

　　乳腺癌是最常见的伴有远处转移的恶性肿瘤之一，临床上常常可见分期很早的病例，术后也进行了正规化疗但仍有远处转移发生。Beitsch等[1]为决定早期及晚期乳腺癌患者带有循环癌细胞的百分比，采用了免疫磁珠分选和流式细胞计数、细胞形态学、免疫细胞化学的方法进行了研究，结果为早期乳腺癌患者20ml血中平均有16个上皮细胞，转移性乳腺癌患者平均有122个肿瘤细胞，是通过细胞形态及免疫染色确定的。对照血标本中每20ml血中有1.7个鳞状上皮细胞。由此可见这方法能够确定循环乳腺癌细胞，且明确转移性乳腺癌比早期乳腺癌有更多的循环癌细胞，这方法能够筛选高危患者，决定是否需要辅助治疗及随访，早期发现乳腺癌的复发。微转移病灶的存在是决定复发率和生存率的关键因素。众多的研究提示有微转移者的预后明显差于无转移者。早期准确地检测外周血肿瘤细胞对及时合理地进行综合治疗很重要，微转移检测阳性者可作为加强辅助化疗的选择性指标，有助于建立个体化的治疗方案，有利于提高患者生存率，降低肿瘤复发率。因此我们在本实验中选择了IL2、ICAM1这两种代表性的细胞因子作为初步反映h32肝癌细胞肺转移程度的指标来预测肿瘤的发生、发展。

　　本实验观察了接种不同数量的h32小鼠肝癌细胞对肺转移率、肺转移程度及ICAM1、IL2表达的影响。结果表明接种1×107细胞浓度组小鼠肺转移率及恶化程度均最高，其中有2只小鼠有脑转移，同时ICAM1蛋白表达明显较其他低浓度组高，而IL2蛋白表达低。

　　综上所述，细胞接种数量与实验性肺转移率及转移程度、ICAM1蛋白呈正相关表达，而与IL2蛋白则呈负相关表达。由此我们可以推测通过检测外周血ICAM1、IL2这两种蛋白表达量的变化来判断肿瘤患者外周血肿瘤细胞量的多少，同时也反映肿瘤的恶化程度及其复发和转移情况，有待实验进一步研究。

参考文献

　[1] Beitsch PD，Clifford E.Detection of carcinoma cells in the blood of breast cancer patients[J].Am J Surg，2000，180(6)： 446449.

　　[2] 高进，钱书森，李宝贵，等.血卟啉激光治疗肿瘤后对肿瘤转移影响的实验研究[J].中华肿瘤杂志，1986，8(4)：256258.

　　[3] Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Estimating the world cancer burden：Globocan 2000[J].Int J Cancer，2001，94：153156.

　　[4] 吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题[J].西医结合">中西医结合学报，2003，1(3)：163164.

　　[5] Simone Mocellinl，Ulrich.Circulating tumor cells： the ‘leukemic phase’ Of solid cancers[J].Trends in Molecular Medicine，2006，12(3)：133139.

　　[6] Ivy H.N.Wong，Winnine Yeo.Circulating timor cells mRNAs in peripheral Blood from hepatocellular carcinoma patients under radiotheraphy，surgical resection or chemotheraphy： a quantitative evaluation[J].Cancer Letters，2001，167：183191.