加味桃核承气汤对肝纤维化大鼠TGFβ1蛋白表达的影响

　　　　 作者：赵治友 邬亚军 张俊杰 林庚庭 周庚生 汪国运

【摘要】 [目的]观察加味桃核承气汤对四氯化碳肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1(TGFβ1)蛋白表达的影响。[方法]用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型，研究分组为正常对照组、模型对照组、加味桃核承气汤高、中、低剂量治疗组和秋水仙碱对照组;灌胃给药，疗程8周;用免疫组化技术检测肝组织TGFβ1的蛋白表达;检测血清ALT、AST水平;用苦味酸天狼红胶原染色方法进行半定量肝纤维化计分(SSS)。[结果]高、中、低剂量组及秋水仙碱组的TGFβ1的表达水平均低于模型对照组;经加味桃核承气汤治疗后血清ALT、AST水平及肝纤维化SSS计分显著下降。[结论]加味桃核承气汤可抑制肝纤维化大鼠TGFβ1的表达，达到抗肝纤维化作用。

【关键词】 加味桃核承气汤;四氯化碳;大鼠;肝纤维化

　　Abstract：[Objective]To study the effects of TGFβ1 of Jiaweitaohechengtang on hepatic fibrosis induced by CCl4 in rats.[Methods]Hepatic fibrosis models were induced by CCl4 in rats.All the experimental rats were pided into six groups： normal control group，model control group，colchicine positive treatment group，highdose，mediumdose，lowdose jiaweitaohechenqitang treatment groups.Drugs were fed on rats for 8 weeks by intragastric administration.Protein expression levels of transfer growth factorsβ1(TGFβ1)were determined with immunohistochemical staining method.Scores of hepatic fibrosis were assessed with semiquantitive scoring system(SSS)through tianlanghong staining.[Results]The protein expression levels of TGFβ1 in the liver tissues in model control group were markedly increased compared with those in normal control group.Scores of hepatic fibrosis and the levels of serum ALT and AST in model control group were higher than those in normal control group，but lower than those in three treatment groups with jiaweitaohechengqitang.There were significant differences between model control group and three jiaweitaohechengqitang treatment groups.[Conclusion]Jiaweitaohechengqitang has therapeutic effects on hepatic fibrosis induced by CCl4 in rats.

　　Key words：jiaweitaohechengqitang;CCl4;rat;hepatic fibrosis

　 肝纤维化是各种不同原因所致慢性肝病的共同病理特征，任其发展可致肝硬化，抗肝纤维化治疗可阻断其向肝硬化进展。加味桃核承气汤在临床用于肝纤维化治疗中取得了很好的疗效，现对该方作深入研究，为临床推广应用该方提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 (1)实验药品：加味桃核承气汤主要由桃仁、桂枝、大黄、甘草、莪术、白术、香附、茯苓等组成，用传统方法浸泡、煎煮、过滤、浓缩，制成煎剂，每毫升含生药2.7g，由浙江中医学院门诊部煎制;秋水仙碱：昆明制药集团股份有限公司。(2)实验动物：SD大鼠，150只，体重160～200g，雌雄各半。由浙江中医药大学动物实验中心提供。(3)主要试剂： 四氯化碳(CCl4)分析纯：上海凌峰化学试剂有限公司橄榄油：上海化学试剂公司;苦味酸、天狼红：美国Sigma公司。兔抗鼠TGFβ1单克隆抗体：武汉博士德公司，二抗：美国Zymed公司;(4)主要仪器：切片机：德国Leca;生物显微镜：日本OLYMPUS CHK;高清晰度彩色病理图文报告分析系统：武汉同济医科大学;电子天平：上海第二天平衡器厂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型复制方法[1] 将 CCl4与橄榄油以4∶6(体积比)配成 40%油剂，首剂按0.5ml/100g体重腹腔注射，以后按 0.3ml/100 g体重腹腔注射，2次/周，第4周末，大鼠中期肝纤维化形成并开始治疗，治疗期间继续CCl4腹腔注射，以维持病因刺激至第12周末。

　　1.2.2 分组 造模过程共死亡8只大鼠，将余下的132只大鼠肝纤维化模型随机分为加味桃核承气汤低剂量组27只、加味桃核承气汤中剂量组27只、加味桃核承气汤高剂量组26只、秋水仙碱组26只、模型对照组26只;造模前设有正常对照组10只。共6组。

　　1.2.3 给药方法 于第4周末开始给药。加味桃核承气汤低、中、高剂量组分别按每100g体重 0.25ml、 0.5ml、1.0ml的剂量灌胃给药;秋水仙碱组按每kg体重0.1mg的剂量，秋水仙碱用生理盐水溶解后灌胃;模型对照组、正常对照组以同体积生理盐水灌胃。疗程均为每天1次，连用8周。

　　1.2.4 标本的提取方法 治疗8周后，股动脉取血作肝功能指标检测;取肝组织用10%福尔马林固定，用作组织病理学观察。

　　1.2.5 观察指标 (1)一般情况：观察大鼠精神、食欲、毛色、二便及舌质的变化，观察肝脏质地。(2)肝功能指标血清ALT、AST测定：日本岛津7200型全自动生化分析仪测定。(3)肝组织病理学观察：肝组织经石蜡包埋、切片，作HE染色、苦味酸-天狼红胶原染色，观察肝细胞变性、纤维组织增生情况。按2000年全国肝炎防治会议制定的标准(2000标准)观察肝纤维化变化情况[2]，再按肝纤维化组织半定量计分系统(SSS)计分[3]。(4)肝组织TGFβ1的蛋白表达，采用免疫组织化学染色法。肝组织经石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、乙醇水化;PBS液洗5min，共3次;3%h3O2室温孵育30min;PBS液洗3次，5min/次;加抗TGFβ1抗体，湿盒内置37℃孵箱内2h;PBS液洗3次，5min/次;加二抗，37℃孵箱内置1h;PBS液洗3次，5min/次;DAB显色10min;流水终止反应3min;苏木素复染3min;流水洗1min;1%盐酸酒精分化;流水蓝化10min;梯度酒精脱水5min;中性树胶封片。检测TGFβ1蛋白表达的半定量方法：用彩色病理图文报告分析系统在低倍镜(100×)下计算每视野棕黄色阳性面积占视野总面积百分比(%)。

　　1.3 统计学方法 运用SPSS12.0统计软件进行统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 一般情况 模型对照组大鼠疲软、不喜活动、饮食减少、皮毛杂乱、便溏、明显消瘦、舌质紫暗、7只出现腹水;秋水仙碱组精神状态及活动情况一般，有2只大鼠出现腹水;高、中、低治疗组精神状态相对较好，皮毛有光泽，无腹水。肝脏质地：模型对照组肝脏颜色灰暗，质硬，肿胀，呈颗粒状;各治疗组情况较好，肝脏质地较软，边缘规则，颜色较前红润，无颗粒状改变。

　　2.2 对肝纤维化大鼠ALT、AST的影响 见表1。

　　2.3 肝纤维化 模型对照组天狼红染色可见汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，大量胶原沉积，相互连接的纤维隔将肝小叶重新分割，形成结节样的假小叶;加味桃核承气汤高、中剂量组天狼红染色可见汇管区有很细很少的纤维隔，且尚未连接;秋水仙碱组有胶原沉积，小叶间有细纤维隔相连，但未见结节样的假小叶。加味桃核承气汤高、中剂量治疗组及秋水仙碱组的肝纤维化SSS计分较模型对照组减少，加味桃核承气汤高、中剂量治疗组SSS计分低于秋水仙碱组。见表1。表1 对肝纤维化大鼠肝功能及SSS计分结果的影响与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;与秋水仙碱组比较△P<0.05

　　2.4 肝组织TGFβ1的表达 在CCl4肝纤维化模型大鼠肝组织中TGFβ1表达广泛且特点相似，在纤维间隔、肝窦、纤维间隔周围的肝细胞、汇管区和中央静脉等均可见表达，显著高于正常对照组;加味桃核承气汤高、中、低剂量组及秋水仙碱组的TGFβ1的表达水平均低于模型对照组。见表2及图1～6。表2 加味桃核承气汤对肝纤维化大鼠TGFβ1表达的影响

　　3 讨论

　　经过多年抗肝纤维化临床实践及对《伤寒论》经方和古、今文献的深入研究，应用加味桃核承气汤治疗慢性肝病肝纤维化取得了很好疗效。祖国医学认为，肝纤维化归属于 “癥瘕”、“积聚”、“胁痛”等范畴，多由感受外邪、湿毒、寄生虫，饮食不节、恣食肥甘酒肉，正气虚弱所致，其病机特点可归纳为“瘀、郁、虚、湿”。当用活血软坚、健脾化湿、疏肝解郁法治疗，以《伤寒论》方桃核承气汤为基础，加莪术、鳖甲以软坚散结，加用丹参、三七以增强活血化瘀之力度，加白术、茯苓、红枣益气健脾化湿，香附疏肝理气，气行则血行，因而全方具有活血软坚、疏肝解郁、健脾化湿之功。用之于临床，则活血而不伤血，化瘀而又能生新，气行瘀去，癥积得消。

　　CCl4诱导的肝纤维化动物模型在形态学、病理生理学的某些方面与人肝纤维化相似;实验动物表现的体征及肝功能异常与人慢性肝病的临床表现接近，因而该造模方法被广泛用于抗纤维化药物的药效评价研究[4]。肝脏组织学检查结果显示，模型对照组肝细胞发生脂肪变性、汇管区胶原纤维沉积，形成假小叶;加味桃核承气汤有效地减轻肝纤维化程度，故具有抗肝纤维化作用。

　　肝纤维化的形成是一个复杂的动态过程，各种细胞因子在肝纤维化的形成中发挥重要的调控作用。根据细胞因子在肝纤维化中的作用不同而分为两类：促肝纤维化和抗肝纤维化作用的细胞因子[5]。对于促肝纤维化的细胞因子中，研究最多的是TGFβ1。在正常肝脏，TGFβ1主要分布于 Kupffer细胞;在纤维化肝脏，激活的肝星状细胞(HSC)不仅自分泌TGFβ1，且能增加TGFβ1与其受体的结合能力，并进一步促进HSC的激活，这种自分泌正反馈调节是肝纤维化得以发展的重要环节[6]。研究普遍认为TGFβ1是最强有力的致纤维化细胞因子，并显著抑制肝细胞的再生，故TGFβ1与肝硬化形成密切相关[7]。从TGFβ1表达的增加或降低，可以判断肝纤维化的进退。本研究TGFβ1蛋白质表达水平显著降低，说明加味桃核承气汤可通过调控细胞因子TGFβ1的表达而产生抗肝纤维化作用。

参考文献

　[1] Montfort I，Perea T，amayo R.Collagenase in Experimental Carbon Tetrachloride Cirrhosis of the liver[J].Am J Pathol，1978，92：411423.

　　[2] 中华医学会传染病与寄生虫学分会和肝脏病学分会联合修订[J].病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志，2000，8(6)：324326.

　　[3] 王泰龄，刘霞，周元平，等.慢性肝炎炎症活动度及肝纤维化计分方案[J].中华肝脏病杂志，1998，6(6)：324329.

　　[4] Jiang Z，You DY，Chen XC，et al.Monitoring of serum markers of fibrosis during CCl4induced licer damageeffects of antifibrotic agent[J].J Hepatol，1992，16(3)： 282289.

　　[5] 王华，魏伟.肝纤维化与细胞因子的关系[J].中国药理学通报，2002，18(2)：132134.

　　[6] Saile B，Mtthes N，Armouche H，et al.The bcl NFKB and p53/p21 WAF1 systems are involved in spontaneuous apoptosis and in the antiapoptotic effect of TGFβ1 or TNFα on activated hepatic stellate cells[J].Eur J Cell Biol，2001，80(8)：554567.

　　[7] Pinzani M，Marra F，Carloni V.Signal transduction in hepatic stellate cells[J].Liver，1998，18(1)：213.