怀牛膝总皂苷对oxLDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖与迁移的影响

　　　　作者：邹小明 周大兴 丁志山 蒋福升 施宏 余佳文

【摘要】 ［目的］探讨怀牛膝总皂苷（ABS）大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响，阐明其抗动脉粥样硬化的机制。［方法］采用oxLDL诱导大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的方法，采用MTT法测定VSMC增殖，采用伤口愈合法测定VSMC迁移能力，观察ABS对oxLDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响。［结果］oxLDL浓度为30mg/L促进VSMC增殖最强；ABS（50、100、150mg/L）显著抑制oxLDL诱导的VSMC增殖，作用呈浓度依赖性；ABS（20mg/L）显著抑制oxLDL诱导的VSMC迁移。［结论］ABS能抑制oxLDL诱导的VSMC增殖与迁移，说明其具有抑制血管内膜增厚和斑块形成的作用。

【关键词】 怀牛膝总皂苷；oxLDL；血管平滑肌细胞；增殖；迁移

　　Abstract：［Objective］To investigate the influence of Achyranthes bidentata saponins（ABS）on the proliferation and migration of rats aorta vascular smooth muscle cells，and to elucidate its mechanism of antiatherosclerosis.［Methods］The oxidized low density lipoprotein （oxLDL） was used to induce the proliferation of rats aorta vascular smooth muscle cells（VSMC） and Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay was used to determine the growth of them，wound healing assay was used to determine the influence of ABS on the ability to migrate of VSMC.All methods were used to observe the effect of ABS on the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.［Result］The proliferation of VSMC was at the highest level when the concentration of oxLDL was 30mg/L，and this effect of oxLDL could be significantly inhibited by ABS（50，100，150mg/L） in a concentrationdependent manner;ABS could also inhibit the migration of VSMC induced by oxLDL at 30mg/L.［Conclusion］ABS could inhibit the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.From these results，it appears that ABS can reduce the thickness of vascular intima and inhibit the development of vascular plaque.

　　Key words：Achyranthes bidentata saponins; oxLDL;vascular smooth muscle cells; proliferation; migration

　　动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发病机理有许多学说，但以氧化损伤学说研究最多［1］。氧化修饰LDL（oxLDL）能促进泡沫细胞形成及血管平滑肌细胞增殖和迁移，导致动脉粥样硬化［2］。本研究采用中医临床治疗心血管疾病的常用药物怀牛膝，观察其对oxLDL诱导的VSMC增殖和迁移的影响，报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　怀牛膝总皂苷（浙江中医药大学化学教研室提供），SD大鼠（浙江中医药大学动物实验中心提供），人血浆（购自浙江省血液中心），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），DMEM（美国GIBCOBRL公司），胰蛋白酶（杭州宏博生物工程有限公司Amresco分装），MTT（华美生物工程公司），二甲基亚砜（浙江杭州双林化工试剂厂），其余试剂为国产分析纯试剂，超速离心机（日本Hitachi公司），荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），UV754紫外分光光度仪（上海分析仪器总厂），HEPA CLASS 100型细胞CO2培养箱（美国THERMO公司），SWCJ1F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），UR4100型酶标仪（美国Dynatech公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 低密度脂蛋白制备、氧化与鉴定

　　参考郭刚等方法［3］，取人血浆，用序列超速离心法，获得LDL区带（密度范围为1.019～1.063）。取LDL于试管中加入CuSO4溶液氧化，使Cu2+终浓度为10μmo1/L，37℃分别孵育20h。氧化后的LDL加入终浓度为20μmol/L EDTA，4℃放置2h终止氧化，再以pH 7.4 PBS缓冲液透析24h除去EDTA，PEG 2，0000浓缩到一定体积。通过Lowery法检测蛋白含量为4.8g/L。制备的oxLDL尽快0.22μm过滤除菌，保存4℃备用，两周内用完。对氧化后的LDL苏丹黑预染，通过琼脂糖凝胶电泳检测oxLDL比LDL迁移速度大。

　　1.2.2 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养

　　参考任立群等方法［4］，雄性SD大鼠处死后，无菌条件下取胸主动脉，去除血管内膜和外膜，将中膜以组织块法培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2孵箱中静置培养。待细胞铺满培养瓶底达80%时，用0.15%胰酶和0.02%EDTA消化，进行传代培养，传代比例为1∶2，传代周期为4～5d。选生长良好的第5～10代传代细胞用于以下实验。

　　1.2.3 确定oxLDL诱导的VSMC生长的最佳浓度

　　取对数生长期的细胞以每孔6000个细胞接种于96孔板中，每孔200μl，分7组，每组6个孔。用含10%FBS的DMEM培养一天后，换用无血清DMFM培养，次日各组换用含5%FBS的DMEM并分别处理如下：第1组不加oxLDL；其余各组加oxLDL，终浓度分别为10，20，30，40，50，60 mg/L，24h后加入5mg/ml MTT，每孔20μL，置37℃，5%CO2培养箱中培养4h后取出，加入二甲基亚砜，每孔150μL，振荡充分溶解结晶。用酶联免疫仪检测在570nm的吸光度值（OD）值（OD值与细胞数正相关），实验重复3次，以每组各孔平均OD值绘制增殖曲线，确定以oxLDL的浓度为30mg/mL促细胞增殖最佳浓度。

　　1.2.4 MTT法测定VSMC增殖的反应

　　取对数生长期的细胞以每孔6000个细胞接种于96孔板中，分5组，每组六个孔。用含10%FBS的DMEM培养一天后换用含5%FBS的DMEM并分别处理如下： 1、空白组；2、oxLDL组：30mg/L oxLDL；3、低剂量组：30mg/L oxLDL+50mg/L ABS；4、中剂量组：30mg/L oxLDL+100mg/L ABS；5、高剂量组：30mg/L oxLDL+150mg/L ABS。24小时后通过MTT法（同上）检测细胞增殖情况。测各孔OD值，实验重复三次，比较每组平均OD值大小差异。

　　1.2.5 伤口愈合法测定VSMC迁移能力

　　参考相关文献方法［5］，取对数生长期的细胞，以每孔5×104个细胞接种于24孔板中，每孔1ml，分3组。用含10%FBS的DMEM培养，待细胞长满瓶底80%左右，用200μl枪头在每个孔中划出基本相同的宽度，5%DMEM培养并分别如下分组：1、空白组；2、oxLDL组：30mg/L oxLDL；3、给药组：30mg/L oxLDL+ 20mg/L ABS，拍照记录，设为0点，用ipp6.0图像处理软件测定划带宽度W0，在显微镜下分别记录并测定24h划带的宽度，每孔取6处划带宽度值求平均值w，计算各个时间段细胞实际迁移距离即h= （W0w）/2，比较每组平均h值大小差异。

　　1.2.6 统计学处理

　　所有数据以表示，由SPSS 13.0软件进行统计分析，数据采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 ABS对oxLDL诱导的VSMC增殖的影响

　　见表1。表1 不同浓度ABS对oxLDL诱导的VSMC增殖的影响（略）

　　2.2 ABS对oxLDL诱导的VSMC迁移能力的影响

　　见表2。表2 ABS对oxLDL诱导的VSMC迁移的影响（略）

　　3 讨论

　　文献表明，oxLDL在AS形成过程中起着重要作用［2］。一方面oxLDL与清道夫受体结合，导致VSMC内吞oxLDL，继而产生平滑肌源性泡沫细胞，而脂质在泡沫细胞中沉积所造成结果是动脉壁的纤维斑块和粥样斑块。另一方面oxLDL通过促进平滑肌细胞释放血小板源生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等因子，而这些细胞因子可促进VSMC增殖和迁移。［3］结果造成血管内膜增厚、斑块形成及管腔狭窄等效应，从而促进 AS 的发生和发展。本实验结果证明ABS能显著抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移，表明ABS抑制血管内膜增厚和斑块形成的作用，这为临床上防治动脉粥样硬化提供可靠的理论依据。

参考文献

　［1］Bediner JA，Heinecke JW.The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis.free radic bio Med，1996，20 （5）： 707727.

　　［2］Zettler ME，Prociuk MA，Austria JA，et al.oxLDL stimulates cell proliferation through a general induction of cell cycle proteins［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284：H644H653.

　　［3］任立群，张秀云，孙波，等.大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块法的培养及鉴定［J］.吉林大学学报（医学版），2002，28 （2）： 135136.