【摘要】 ［目的］观察槲皮素锌配合物的体内外抗肿瘤作用及其机制。［方法］采用四氮唑盐（MTT）法观察槲皮素锌配合物对人肝癌细胞HepG2的抑制率，并采用流式细胞术（FCM）观察分析癌细胞周期；通过建立荷瘤小鼠模型，观察槲皮素锌配合物对S180荷瘤小鼠瘤重和h32小鼠生存时间的影响，观察其体内抗肿瘤作用。［结果］槲皮素锌配合物可显著抑制HepG2的体外增殖，且抑制作用呈浓度依赖性，可使G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少。对S180小鼠的瘤体生长有显著的抑制作用，对h32小鼠的生存时间有显著的延长作用。［结论］槲皮素锌配合物在体内、外均能有效抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导HepG2肿瘤细胞的凋亡。
【关键词】 槲皮素；锌；金属配合物；抗肿瘤作用；细胞凋亡；HepG22
Abstract：［Objective］To study the antitumor functions and tumor cell apoptosis induced by Quercetin Zn.［Methods］MTT assay was applied to study the antitumor activities of quercetin Zn in HepG2 cell lines in vitro，and apoptotic cell was analyzed by flow cytometry.The in vivo antitumor action was studied by observing the variation of tumor weight and survival time of S180 and h32 mice.［Results］Quercetin Zn can inhibit HepG2 cells from growth and proliferation，and evoke apoptosis.Flow cytometry showed that it caused an increase at G0/G1 phase and a decrease at G2/M phase and arrest at G0/G1 phase in the cell cycle.It also can inhibit the growth of cancer cells of S180 mice and prolong the survival time of h32mice.［Conclusion］Quercetin Zn has antiproliferative and proapoptotic effect on tumor cells in vivo and in vitro.
Key words：Quercetin；Zn；metal complexes；antitumor；cell apoptosis；HepG22
槲皮素（Quercetin，Que，3，5，7，3’，4’五羟基黄酮），广泛存在于多种植物中，尤以红麻叶和湖南连翘中含量较高，具有降血压、降血脂、抗炎、抗过敏、清除氧自由基和抗心律失常等多种生物活性及药理作用［1］。本课题组前期采用槲皮素与氯化锌反应合成了槲皮素锌配合物，发现其具有显著的抗氧化作用。本文旨在通过体内外抗肿瘤实验，进一步探讨其对肿瘤细胞的抑制作用，为其药物应用提供依据。
1 材料
1.1 仪器
BS224S精密电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。恒温CO2培养箱，美国TEC公司。奥林巴斯CKX4132荧光倒置显微镜，日本Olympus公司。ClassⅡ Type/A/B2生物安全柜，美国Beker公司。低温超速离心机，美国Beckman公司。353酶标仪，美国TEC公司。
1.2 实验对象
清洁级昆明小鼠，18～22g，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（沪）20070005。S180、h32和HepG2细胞株，购自杭州昊天生物技术有限公司，本室常规传代保种。
1.3 主要试剂
槲皮素，上海晶纯试剂有限公司。氯化锌，温州化学用料厂。RPMI1640培养基，Gibco公司。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。5氟脲嘧啶（5Fu），上海旭东海普药业有限公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT），Sigma公司。注射用环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司。
2 方法
2.1 槲皮素
锌配合物的合成 将4mmol槲皮素加至50ml无水乙醇，60℃水浴搅拌至溶解，再加入3mmol的氯化锌，60℃回流6h，冷却，抽滤，并用10ml热无水乙醇洗涤几次，抽滤，真空干燥，得槲皮素锌配合物。
2.2 体内抗肿瘤实验
2.2.1 对S180小鼠瘤重的影响。取昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分组，分别为模型对照组，CTX阳性对照组，槲皮素对照组，槲皮素锌配合物高、中、低剂量组。分组后连续ig给药3d，给药量为0.4ml/20g，模型对照组给同体积蒸馏水，阳性对照组给同体积5Fu （0.50 g/kg）。第4天接种S180瘤株。取接种生长良好的S180荷瘤小鼠，无菌条件下抽取腹水，在冰浴条件下灭菌生理盐水与腹水按4∶1稀释，混匀制成肿瘤细胞混悬液。将制备好的S180肿瘤细胞混悬液按每只0.2 ml接种于昆明种小鼠右侧腋窝皮下。接瘤后继续给药7d。停药后第2天剥瘤、称质量，计算抑瘤率。抑瘤率=（对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%
2.2.2 对h32小鼠生存时间的影响。小鼠分组、给药及接瘤方法同2.2.1项。接瘤后继续给药10d。停药后第2天开始观察记录各组小鼠的死亡数。各组小鼠全部死亡后，计算生命延长率。生命延长率=（给药组平均生存天数-对照组平均生存天数）/对照组平均生存天数×100%
2.3 体外抗肿瘤实验［2］
2.3.1 对HepG2增值的影响。取培养3～4d处于指数生长期的培养细胞一瓶，加入适量的0.25%TrypsinEDTA液，使贴壁细胞脱落，用10%胚牛血清的RPMI 1640培养基配成1×104个细胞/mL悬液。取96孔平板，每孔加细胞悬液100μl，置37℃、5%CO2及100%湿度培养箱中培养24h后，每孔加入不同浓度的槲皮素锌配合物，每个浓度设6个复孔，同时设溶剂对照组，槲皮素对照组。继续置培养箱培养24～72h。MTT用无血清RPMI1640培养基配成1mg/ml溶液，每孔加50μl，37℃温浴4h，去上清液，加入200μlDMSO，振摇5min，以相应试剂为空白，用酶标仪于490nm处读取各小孔的吸光度。以溶剂对照组处理的肿瘤细胞为对照组，计算药物对肿瘤细胞的抑制率。
2.3.2 流式细胞术测定细胞周期分布和凋亡细胞比率。细胞经以上4种浓度的槲皮素锌配合物及生理盐水（对照组）作用24h后，0.02%EDTA消化、1000r/min离心5min，弃上清、冷PBS缓冲液洗2次。将细胞重悬于PBS液中，调整密度为1×109/L，用400目筛网过滤两次，制备的单细胞悬液用700 mL/L乙醇固定， 4℃保存过夜，1000r/min离心5min，弃上清，加200μl RNaseA于37℃水浴30 min，再加入600mg/L碘化丙啶染色液500μl混匀，避光30min后用流式细胞仪检测，用CellQuest及Modfit软件分析细胞周期，确定细胞周期分布。
细胞凋亡率=凋亡细胞数/（凋亡细胞数+未凋亡细胞数）×100%
3 结果
3.1 体内抗肿瘤实验
3.1.1 对S180小鼠瘤重的影响。由表1可知，槲皮素锌配合物低、中、高（0.5、1.0和2.0mg/kg）3个剂量对S180实体型肿瘤生长有明显的抑制作用，且作用优于槲皮素。
3.1.2 对h32小鼠生存时间的影响。由表2可知，槲皮素锌配合物低、中、高（0.5、1.0和2.0mg/kg）3个剂量对h32小鼠的生存时间有显著的延长作用，与CTX对照组相比，无显著性差异（P>0.05），与槲皮素对照组相比，也无显著性差异（P>0.05）。表1 槲皮素锌配合物对S180小鼠瘤重的影响（略）表2 槲皮素锌配合物对h32小鼠生存时间的影响（略）
3.2 体外抗肿瘤实验
3.2.1 对HepG2增值的影响。由表3可知，槲皮素及槲皮素锌配合物对肿瘤细胞HepG2的生长有明显的抑制作用，且随药物作用浓度的升高而增强，存在浓度依赖性。其中16、32mg/L浓度剂量组的抑瘤率超过5Fu对照组（66.99%）。槲皮素锌配合物对HepG2的抑制作用优于槲皮素，其IC50为11.58mg/L，显示出较强的抑制瘤细胞增殖作用。表3 槲皮素锌配合物对HepG2增值的影响（略）
3.2.2 流式细胞术测定细胞周期分布和凋亡细胞比率。由表4可知，槲皮素及槲皮素锌配合物均能阻止肿瘤细胞HepG2由G0/G1期向S期和G2/M期移行，使细胞阻滞于G0/G1期，呈浓度依赖性。在等剂量下，槲皮素锌配合物的抑制作用强于槲皮素。表4 槲皮素锌配合物对HepG2细胞周期的影响（略）
4 讨论
4.1 在酸性和中性条件下，槲皮素较稳定，不发生自氧化作用，但产率较低，尤其在酸性条件下。而在碱性溶液中，由于槲皮素的3，3’，4’-三个羟基基团对碱敏感，易发生自氧化作用，且Zn2+离子与槲皮素形成配合物后，通过共轨效应使槲皮素自氧化的中间体氧阴离子自由基的电荷密度降低，使槲皮素自氧化反应中间产物更稳定，故能加快槲皮素的自氧化速度，使其生物活性降低。因此，配合物的合成宜在中性条件下反应，并在真空条件下干燥。
4.2 采用MTT法测定槲皮素
锌配合物对HepG2细胞的生长抑制作用。结果表明槲皮素锌配合物对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，并呈明显的剂量依赖性，并确定了槲皮素锌配合物作用于HepG2细胞48h的半数抑制浓度IC50（11.58mg/L），且对肿瘤细胞生长的抑制作用明显强于配体槲皮素。
流式细胞分析证明槲皮素锌配合物对肝癌HepG2细胞生长的抑制作用可能是通过使细胞阻滞于G0/G1期，使细胞DNA合成速度降低，细胞周期的循环被抑制而实现的。对G0/G1期细胞阻滞可能是配合物诱导HepG2细胞凋亡的一个重要机制。
体内药效学实验结果表明，槲皮素锌配合物（0.5～2.0mg/kg）对S180A小鼠的瘤体生长有一定的抑制作用，在等剂量下，槲皮素锌配合物的抑制作用强于槲皮素。对h32小鼠的生存时间也有一定的延长作用，但槲皮素锌配合物与槲皮素的作用无显著性差异，这可能与肿瘤株或槲皮素及其金属配合物体内代谢过程有关，有待进一步研究。
参考文献
［1］Nijveldt R J，Van Nood E，Van Hoorn D，et al.Flavonoids：a review of probable mechanisms of action and potentials applications［J］.AmJ Clin Nutr，2001，74：418425.
［2］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2006：1012.