健肾颗粒剂对糖尿病肾病大鼠肾脏组织TGFβ1、ET1mRNA及肾功能的影响

　　　　 作者：徐丽梅 马建伟 马新英 魏汉林 董静 张文龙 蔡庆

【摘要】 ［目的］观察中药健肾颗粒剂对DN大鼠肾脏组织中TGFβ1、ET1 mRNA及肾功能影响。［方法］采用5/6肾切除加尾静脉注射STZ的方法复制大鼠DN动物模型，并随机分成健肾颗粒剂、苯拉普利、保肾康、病理对照及正常对照组，采用生化法检测肾功能， PCR 方法检测肾脏组织中TGFβ1 、ET1 mRNA，组织病理学方法观察肾脏组织结构。［结果］健肾颗粒剂组大鼠血中Cr、BUN水平低于苯拉普利、保肾康及病理对照组（P<0.05或P<0.01）；健肾颗粒剂组肾脏组织中TGFβ1 、ET1 mRNA表达明显低于其他三组（P<0.05或P<0.01），肾脏组织病理结构也较其他三组有明显改善；健肾颗粒剂降低DN大鼠血糖、尿蛋白及血脂的作用明显优于苯拉普利、保肾康及病理对照组（P<0.05或P<0.01）。［结论］健肾颗粒剂可明显改善DN大鼠肾功能，并有降血糖、调整血脂，下调DN大鼠肾脏TGFβ1、 ET1mRNA的作用。

【关键词】 糖尿病肾病； 健肾颗粒剂；转化生长因子β1； 内皮素1

　　Abstract：［Objective］To explore the effects of TCM Jianshen Granule on kidney TGFβ1，ET1mRNA and function of rats.［Method］Take 5/6 kidney resection and tail vein injection of STZ to copy rats DN model，and randomly pide them into groups of Jianshen Granule（1）Benazeprilat（2），Baoshen Kang（3），pathological control（4）and normal control（5），take biochemistry method to observe kidney tissue.［Result］The TGFβ1 and ET1 mRNA expression in group 1 is markedly lower than other 3 groups，so is its kidney pathological structure much relieved；Jianshen Granule is much better than Benazeprilat，Baoshen Kang and group 4 on reducing glucose，urinary protein and lipid.［Conclusion］Jianshen Granule can obviously improve DN rats’ kidney function，also reduce glucose，regulate lipid，downregulate TGFβ1 and ET1mRNA as well.

　　Key words：DN；Jianshen Granule；TGFβ1；ET1

　　糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症之一，是导致死亡的重要原因，但目前治疗上尚缺乏理想的方法。我们在健肾冲剂治疗慢性肾衰的基础上，为进一步探讨其对糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的作用，将其改进为无糖型颗粒剂，并观察了该方对DN大鼠肾功能、肾脏组织结构及肾脏TGFβ1、 ET1mRNA的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　实验动物：雄性Wistar大鼠50只，体重190～220g，购于军事医学科学院动物实验中心。实验药物及试剂 健肾颗粒剂（主要药物为黄芪、山萸肉、山药、茯苓、当归、莪术等，由本院制剂中心制成无糖型颗粒剂），每袋5g。保肾康片，成都亨达制药厂生产，批号980605；苯拉普利，瑞士诺华制药有限公司制造，批号011400。链尿佐菌素（STZ）为美国Sigma公司产品。总RNA提取试剂盒由美国GibcoBRL公司提供，反转录PCR试剂盒由Promega公司提供，TGFβ1、GAPDH引物由军事医学科学院提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DN模型制作及动物分组

　　40只大鼠常规麻醉，消毒后，腹部正中纵切口，暴露肾脏，剥离肾包膜，右肾结扎切除，左肾切除上下极后，明胶海棉止血，关闭腹腔，1周后每只大鼠按40 mg/kg体重尾静脉注射STZ（用0.1mmol／L pH4.5的枸橼酸酸缓冲液，将STZ配成2%的溶液，4 ℃冰箱保存，新鲜配制）。72h后测定空腹血糖＞16mmol／L，尿糖呈强阳性，尿量超过正常组50%的大鼠为DN实验动物，给予高蛋白、高脂肪饲料喂养。然后将40只大鼠随机分成4组，每组10只。健肾颗粒剂组，每天按4g/kg给药；保肾康组，每天按34mg/kg给药；苯拉普利组，每天按3.4 mg/kg给药；病理对照组，每天予2 ml蒸馏水，灌饲。另设1组10只正常大鼠同时饲养作为空白对照。5组大鼠均喂养12周。标本采集 于12周在代谢笼内收集每只大鼠24 h尿， 12周末常规麻醉，腹腔静脉取血，并取残肾留做病理及相关检查。

　　1.2.2 观察指标及方法

　　（1）生化检测：血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、血糖（Glu）。（2）大鼠肾组织TGFβ1、 ET1 mRNA测定采用半定量反转录聚合酶链反应（Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RTPCR）技术。（3）24 h尿蛋白测定：采用双缩尿法。（4）肾脏组织病理学观察：采用HE、PAS染色，光镜下观察。电镜观察：取肾皮质削成1.0 mm3小块组织数块，用2.5%戊二醛前固定，1%饿酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon812包埋，超薄切片（厚度80 nm），醋酸铀与枸橼酸铅双重染色，于电镜（PHILIPS CM 100）下观察。

　　1.2.3 统计学处理

　　数据描述以均数±标准差（x±s）表示。数据推断采用SPSS 13.0软件包统计，采用t检验、方差分析。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠血中Cr、BUN、TC、TG、Glu的变化 见表1。表1 各组大鼠Cr、BUN、TC、TG、Glu变化（略）

　　2.2 各组大鼠肾脏组织中TGFβ1 mRNA的表达及24h尿蛋白变化

　　见表2。用RTPCR 扩增TGFβ1、ET1和GAPDH基因，结果各组TGFβ1和ET1扩增带不尽相同，而GAPDH则均匀一致，其扩增带的明亮程度依次是病理组>保肾康组>苯拉普利组>健肾颗粒剂组>正常组。各组大鼠TGFβ1/GAPDH和ET1/GAPDH比率以病理对照组升高最明显，较正常对照组、健肾颗粒剂组、苯拉普利组及保肾康组有显著差异（P<0.01）；而健肾颗粒剂组较苯拉普利组、保肾康组及病理对照组明显低下（P<0.05，P<0.01）。表2 各组大鼠肾脏TGFβ、ET1及24h尿蛋白定量变化（略）

　　2.3 光镜结果

　　病理组肾小球体积明显增大，球囊粘连明显，肾小球系膜细胞增生明显，系膜基质增宽；保肾康、苯拉普利组肾小球体积增大，球囊粘连较病理对照组轻，肾小球系膜细胞轻、中度增生，系膜基质轻度增宽；健肾颗粒剂组，肾小球体积稍有增大，球囊粘连程度最轻，肾小球系膜细胞轻度增生，系膜基质稍有增宽。

　　2.4 电镜结果

　　各模型组大鼠可见到肾小球基底膜不均质增生，有的模糊不清，肾小球上皮细胞增生、肿胀、足突融合、低矮、扁平、以及假绒毛样变，系膜细胞增生，基质增生，毛细血管扩张、细胞堆积等病理变化。健肾颗粒剂组虽然也有类似病理变化，但其程度明显较其它组减轻。

3 讨论

　　本研究发现健肾颗粒剂、苯拉普利及保肾康均有不同程度降低DN大鼠血Cr、BUN及24h尿蛋白的作用，但健肾颗粒剂降低血Cr、BUN，24h尿蛋白的作用均较苯拉普利及保肾康明显（P<0.05或0.01），表明该方有较好的改善肾功能的作用；而健肾颗粒剂组与病理组、苯拉普利组和保肾康组比较有明显的降血糖作用（P<0.01或0.05）。有资料显示2型糖尿病伴有脂代谢异常，脂代谢异常加重糖代谢紊乱，并参与对糖尿病肾病的影响［1］。本研究中发现健肾颗粒剂组与病理组、苯拉普利组及保肾康组相比较有明显降低血脂的作用（P<0.01或P<0.05），说明该方能改善DN大鼠脂代谢紊乱，有助于减轻DN大鼠的肾脏损害。

　　转化生长因子β1（TGFβ1）是一种细胞调节因子，在DN的发生发展中具有重要的调节作用［2］。Yokotama H等报道［3］，高血糖时，肾小球内压增高和糖化蛋白均可诱导TGFβ1mRNA的过形成，从而刺激MC、ECM增生导致肾小球硬化。本研究中发现病理对照组大鼠残肾组织中的TGFβ1mRNA 表达较健肾颗粒剂、苯拉普利及保肾康组明显增强（P<0.01），而健肾颗粒剂组TGFβ1mRNA 表达最弱，与苯拉普利及保肾康组比较有显著性差异（P<0.05），表明该方有下调TGFβ1mRNA 表达的作用。

　　ET主要产生于血管内皮细胞，在肾脏主要由内皮细胞、上皮细胞及肾小球系膜细胞产生［4］。本研究中发现各模型组肾组织中ET1mRNA 表达均较正常组明显升高（P<0.01），而模型组中以病理对照组肾组织中ET1mRNA表达最明显，与其它3个治疗组比较有显著性差异（P<0.01）。在3个治疗组中，健肾颗粒剂肾组织中ET1mRNA表达减弱程度最明显，与保肾康组及苯拉普利组比较有显著性差异（P<0.01），表明虽然各治疗组均有下调ET1mRNA 表达的作用，而以健肾颗粒最佳。

　　研究结果提示，健肾颗粒剂可能是通过抑制或阻止TGFβ1mRNA 、ET1mRNA表达，延缓肾小球硬化的发生，从而减轻肾损害。光镜观察DN大鼠肾小球系膜细胞增生明显，基质增多，GBM弥漫性增厚，肾小管腔可见渗出蛋白及肿胀；健肾颗粒剂组、苯拉普利组也有类似病理改变，但明显较病理对照组减轻；电镜观察病理对照组见到肾小球GBM不均质性增厚，有的模糊不清，肾小球上皮细胞增生、肿胀，足突融合、低矮、扁平以及假绒毛样变，系膜细胞增生，基质增生，毛细血管扩张、红细胞堆积等病理变化，健肾颗粒剂组、苯拉普利组也有类似病理变化，但明显减轻，特别是健肾颗粒剂组。由此表明，健肾颗粒剂可改善DN大鼠肾脏的病理结构。通过本研究证实健肾颗粒剂有较好的改善DN大鼠肾功能的作用，其机理可能与降低血糖、调整血脂，下调肾脏组织中 TGFβ1、 ET1mRNA，改善肾脏组织病理结构，阻止肾小球硬化的发生有关。

参考文献

　［1］王惠芳.血脂异常对糖尿病肾病的影响［J］.西安医科大学学报，2002，23（3）：280.

　　［2］谭燕，杨永平.TGFβ在糖尿病肾病发病机制的作用及意义［J］.中国糖尿病杂志，2000，8（3）：178180.

　　［3］Yokotama H，Deckert T.Central role of TGFβin the pathogensis of diabetic nephropathy and macrovascular complications：a hypothesis［J］.Diabetic Medicine，1996，13：313.

　　［4］Kohan D E.Endothelins in the kidney：physiology and pathophysiology［J］.Am J Kidney，1993，22（4）：493.