柚皮苷对小鼠成骨细胞MC3T3E1增殖功能的影响

　　　　 作者：唐琪 王维倩 王仁飞 丁佩惠 陈莉丽

【摘要】 [目的]检测柚皮苷溶液对成骨细胞株MC3T3E1细胞增殖功能的影响。[方法]以成骨细胞株MC3T3E1细胞为体外药效的试验模型，通过CCK8法观察各种浓度的柚皮苷溶液对MC3T3E1细胞增殖能力的影响。[结果]高浓度的柚皮苷溶液在12h和24h时能促进MC3T3E1细胞的增殖作用。而低浓度的柚皮苷溶液则无此作用。但是48h时各个浓度的柚皮苷溶液均不能促进细胞增殖。所测的各个组别细胞毒性百分比都较小，且随着时间的推移(12h，24h，48h)变化较小。光镜下观察各个时间点细胞的密度和形态也未发生明显的变化。[结论]柚皮苷溶液可以提高成骨细胞株MC3T3E1增殖能力。

【关键词】 柚皮苷;成骨细胞;骨碎补;增殖

　　Abstract：[Objective]To observe the effect of naringin solution on osteoblast line MC3T3E1 proliferation.[Method]Take MC3T3E1 as test model in vitro potency，observe the influence of all concentrations of naringin solutions on MC3T3E1 proliferation with CCK6 method.[Result]High concentration of narigin solution can promote MC3T3E1 proliferation at 12h and 24h;while the low concentration of that has no such action.But at 48h，all concentrations of the solutions can not promote cell proliferation.The tested groups of cell toxin all have small percentage，and have little change with time passing by(12h，24，48h).Under microscope，the cell concentration and shape have no marked change either.[Conclusion]Narigin solution can improve the osteoblast line MC3T3E1 proliferation ability.

　　Key words：narigin;osteoblast;Rhizoma Drynariae;proliferation

　　骨碎补为骨伤科常用中药，具有补肾强骨、续伤止痛等功效[1]。以往的研究发现，骨碎补水提液和醇提液能促进小鼠成骨细胞株MC3T3E1的增殖、分化和钙化作用;能抑制大鼠实验性牙槽骨吸收[23]。我们在以往研究成果的基础上，综合国内外文献，考虑从骨碎补主要成分之一柚皮苷着手进行药效鉴定，研究其对小鼠成骨细胞株MC3T3E1增殖的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞株及培养液 小鼠成骨细胞株MC3T3E1为浙江大学医学院病原生物学实验室提供，培养液为含10%(V/V)胎牛血清的αMEM(Gibco)。

　　1.2 实验药品 柚皮苷购自中国药品生物制品检定所(批号110722200309)，二甲基亚砜(DMSO)来自Sigma公司。5.805mg柚皮苷溶于1ml二甲基亚砜中，以0.22um过滤膜滤过，终浓度为1×10-2M，作为母液，-70℃保存。再用10%胎牛血清或者1%胎牛血清的αMEM培养液稀释成以下浓度梯度备用：10UM，1UM，0.1UM，0.01UM，0.001UM，0.0001UM。为了避免二甲基亚砜造成细胞损伤，培养液中其终浓度必须小于等于0.1%。CCK8试剂盒购自上海同仁化学研究所。乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒购自美国罗氏公司。

　　1.3 检测指标

　　1.3.1 细胞增殖效应检测 采用CCK8法检测细胞增殖效应。96孔板中每孔接种1×105/mlMC3T3E1细胞。24h后，更换培养液并添加含10%胎牛血清各柚皮苷溶液100ul，浓度分别为10UM，1UM，0.1UM，0.01UM，0.001UM，0.0001UM。添加等体积含10%胎牛血清培养基作为阴性对照组，同时设立不加细胞的空白对照组。各为6复孔，分别添加12h，24h，48h。到规定的时间点后，各孔加入10ul的CCK8溶液。37℃敷育2h，测定450nm处的吸光度值。

　　1.3.2 细胞毒性效应检测 采用乳酸脱氢酶试验进行检测。96孔板中每孔接种1×105·ml-1MC3T3E1细胞。24h后，更换培养液并添加含1%胎牛血清各柚皮苷溶液100ul，浓度分别为10UM，1UM，0.1UM，0.01UM，0.001UM，0.0001UM。添加等体积含1%胎牛血清培养基设置两组对照组即毒性低对照组和高对照组。同时设立不加细胞的空白对照组。各为6复孔，分别添加12h，24h，48h。到了规定的时间点后，高对照组添加2%TritionX100，37℃敷育15min。后各孔分别添加100ul的反应液混合物(现配)，常温下避光敷育8min。加50ul的终止液，振荡10s。酶联免疫仪490nm/630nm双波长测吸光度。按照公式细胞毒性百分比=(样本组-低对照组)/(高对照组-低对照组)×100%。

　　2 结果

　　2.1 CCK8法检测结果 CCK8法结果表明：12h时，高浓度的柚皮苷溶液能显著促进成骨细胞增殖，而低浓度的柚皮苷溶液则无此作用。10UM的柚皮苷溶液与对照组比较能显著促进MC3T3E1细胞增殖(P<0.001)。1UM和0.1UM的柚皮苷溶液与对照组比较能促进MC3T3E1细胞增殖(P<0.05)。24h时，10UM和1UM的柚皮苷溶液与对照组比较能促进MC3T3E1细胞增殖(P<0.05)。48h时，各个不同浓度的柚皮苷溶液均无促进细胞增殖作用(见图1)。

　　图1 不同浓度的柚皮苷溶液对MC3T3E1细胞CCK8吸光度的影响(x±sD，n=6)2.2 细胞毒性测定(LDH test)结果 所测的各个组别细胞毒性百分比都较小，且随着时间的推移(12h，24h，48h)变化较小(见图2)。光镜下观察各个时间点细胞的密度和形态也未发生明显的变化。

　　图2 不同浓度的柚皮苷溶液对MC3T3E1细胞毒性的影响(x±sD，n=6)3 讨论

　　MC3T3E1细胞株是1981年日本学者Kodama等从新生C57BL/6小鼠颅顶骨中分离培养所建立的成骨细胞株。该细胞株具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原合成和基质矿化等，是一株良好的体外培养成骨细胞株，已成为研究药物对成骨细胞影响的有价值的体外细胞模型。本实验分别检测了不同浓度的柚皮苷溶液对MC3T3E1细胞增殖功能的影响。

　　CCK8法结果表明：高浓度的柚皮苷溶液能显著促进成骨细胞增殖，而低浓度的柚皮苷溶液则无此作用。而且随着时间的推移，浓度较低的柚皮苷溶液的有效性降低，说明柚皮苷对细胞增殖的促进作用有一定的时效性。总体来说，柚皮苷溶液在一定浓度范围内、在一定的时间内，对成骨细胞增殖有一定的促进作用。

参考文献

　[1] Sun J S，Lin C Y，Dong G C，et al.The effect of GuSuiBu (Drynaria fortunei J.Sm) on bone cell activities[J].Biomaterials，2002，23(16)：3377.

　　[2] 唐琪，陈莉丽，严杰.骨碎补提取物促小鼠成骨细胞株MC3T3E1细胞的增殖、分化和钙化作用的研究[J].中国中药杂志，2004，29(2)：164.

　　[3] 陈莉丽，唐琪，严杰.骨碎补提取液对实验性牙槽骨吸收疗效的研究[J].中国中药杂志，2004，29(6)：549.