COX2基因在大肠癌的表达及其意义

　　　　 作者：王淑强 李秀娟 李鹏 武欣 王琳冬

【摘要】 目的 探讨COX2基因在大肠癌中表达的意义。方法 收集手术切除的大肠癌标本58例，同时选取大肠癌远端正常黏膜组织10例，应用流式细胞术（FCM）检测大肠癌及正常黏膜中COX2表达情况，根据平均荧光强度计算荧光指数（FI）。 结果 COX2表达平均FI值正常黏膜组为1.00±0.28，高、中、低分化及黏液癌组分别为2.47±1.41、2.70±1.08、3.16±1.34和2.01±1.43，高、中、低分化及黏液癌组COX2表达均明显高于正常黏膜组（P＜0.01）；大肠癌淋巴结转移组平均FI值（2.45±1.41）显著高于无淋巴结转移组（1.61±1.27）（P＜0.05）。COX2的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位等无关。结论 COX2在大肠癌中表达异常增高，并与淋巴结转移密切相关。

【关键词】 大肠癌；COX2；流式细胞术

　　近年来研究表明，环氧合酶(COX)2在多种肿瘤中均呈高表达，在肿瘤发生、发展、分化、转移中起重要作用。在细胞癌变过程中，Wnt通路异常变化可能具有重要作用，COX2是Wnt通路的靶基因，可通过增强MMPs的表达，促进肿瘤的转移〔1〕。本研究采用流式细胞术检测大肠癌及大肠远端正常黏膜中COX2的表达情况，探讨COX2在大肠癌发生、发展和转移中的作用，为预测大肠癌浸润和转移提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集手术切除的大肠癌标本58例，男28例，女30例，年龄30～78岁（平均58.3岁）。病变部位：结肠癌22例，直肠癌36例；分化程度：高分化腺癌26例，中分化腺癌20例，低分化腺癌6例，黏液腺癌6例；转移情况：有淋巴结转移31例，无淋巴结转移27例。同时选取大肠癌远端正常黏膜组织10例。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂

　　兔抗人COX2单克隆抗体（Santa Crus Biotechonlogy，INC），羊抗兔IgGFITC，DAB显示剂，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2.2 实验步骤

　　单细胞悬液的制备：石蜡包埋组织HE染色，切成40 μm厚的组织片5片，放入10 ml的试管中，加入二甲苯8 ml，在室温下脱蜡2 d，其间更换2次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5 ml，每步10 min，加入蒸馏水 5 ml，10 min后弃之。加入2 ml 0.5%胰蛋白酶（pH1.5）消化液，置37℃恒温水浴中消化30 min，在消化期间，每隔10 min用振荡器振荡1次，消化30 min后，立即加生理盐水终止消化，经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化。收集细胞悬液，以1 500 r/min离心沉淀5 min，再用生理盐水漂洗2次，以800 r/min离心沉淀5 min，去碎片。细胞的免疫荧光标记：取单细胞悬液1×106/ml，加入兔抗人COX2单克隆抗体工作液0.1 ml室温孵育30 min，加入PBS 10 ml 洗涤1次，弃上清，加入羊抗兔FITCIgG二抗工作液10 ml，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml，800 r/min离心沉淀5 min，弃上清除去未结合的荧光二抗，上机检测并加入PBS 0.1 ml 经500目铜网过滤后上机检测。蛋白免疫荧光标记物测定设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。检测条件及参数采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXLII型流式细胞仪，应用Expo32 ADC软件分析数据。测定前以Flow check标准微球调整仪器的CV值在2%以内。

　　1.2.3 结果判定

　　根据流式细胞仪分析软件测定出的平均荧光强度（Mode值）计算荧光指数（FI），并以FI表示COX2基因蛋白表达的强弱。FI=（样品基因蛋白的表达荧光强度-正常样品的荧光强度）/正常样品的荧光强度。

　　1.3 统计学处理
　　
　　数据分析采用SPSS11.0统计软件进行统计分析。数据用x±s表示，采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 COX2基因在正常黏膜和不同分化组中的表达

　　COX2表达平均FI值正常黏膜组为1.00±0.28，高、中、低分化及黏液腺癌组分别为2.47±1.41、2.70±1.08、3.16±1.34和2.01±1.43，高、中、低分化及黏液腺癌组COX2表达均明显高于正常黏膜组（P＜0.01）。

　　2.2 COX2基因在大肠的表达与临床病理特征的关系

　　见表1。大肠癌COX2基因表达在有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组（P＜0.05），与大肠癌患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位等无关。表1 COX2基因在大肠癌中的表达与临床病理特征的关系(略s)

　　3 讨 论

　　人的COX2基因定位于第一号染色体1q25.225.3，长约8.3 kb，其mRNA约4.5 kb，由10个外显子和9个内含子构成；COX2基因的3URT区域包含1.5 kb的22个AUUUA基因序列，与mRNA不稳定有关〔2〕。COX2基因编码604个氨基酸，含17个氨基酸残基的信号肽。COX是一种与生物膜相结合的花生四烯酸转化为前列腺素过程中发挥作用的限速酶。COX2基因为诱导型蛋白，被认为是“快速反应基因”，静息时不表达，当细胞受到各种刺激时则迅速合成，表达增加癌症的发生是原癌基因激活和抑癌基因失活为基础的多步骤、多阶段过程，通常其表达产物作用于细胞生长、分化及代谢过程，最终导致癌变。COX2在多种肿瘤如食管癌、肾癌、胰腺癌等组织中均有表达，研究表明，它在肿瘤的增殖、凋亡及转移中发挥重要作用。COX2促进肿瘤的发生和肿瘤的恶性表型转换的可能机制〔3〕：（1）对细胞凋亡的抑制：可通过减弱和抑制NO信号途径来抑制细胞凋亡。（2）促进肿瘤血管的发生：血管内皮细胞通常不会增生，除非受到某些刺激，肿瘤血管的形成是针对不同因子的刺激而发生。VEGF作用于血管内皮细胞，通过增高血管内皮细胞渗透性和促进内皮细胞变形、迁徙等促进肿瘤血管生成〔4〕。研究证实，COX2表达与VEGF的表达呈正相关〔5～7〕。（3）促进肿瘤细胞的侵袭和转移：COX2高表达还常导致一种浸润抑制因子Ecadherin在细胞中缺失，Ecadherin缺失有利于肿瘤细胞的侵袭转移。（4）调节免疫抑制功能。（5）导致原癌基因的激活和抑癌基因的缺失或突变：COX2在正常大肠黏膜中检测不到，而在80%的大肠癌中呈过表达。Lambropoulou等〔8〕发现，在子宫内膜癌中COX2的表达与肌层浸润深度密切相关，提示COX2表达与肿瘤的局部扩散有关。姚楠〔9〕研究显示，COX2在大肠腺癌的发展过程中其表达呈增高趋势，提示COX2在大肠腺癌的发展过程中起着重要作用。本研究显示，正常黏膜组COX2表达平均FI值明显低于高、中、低分化组，提示COX2可能在大肠癌的发生、发展过程中发挥着重要作用。同时还显示，淋巴结转移组COX2表达平均FI值显著高于无淋巴结转移组，提示COX2的高表达预示着大肠癌患者有较高的淋巴结转移率，而淋巴结转移是影响大肠癌患者预后的重要指标，但COX2的表达与患者的年龄、性别、发生部位、分化程度等无关。

参考文献

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　　9 姚 楠，李俊刚，高 倩，等.环氧化酶2在大肠癌中的表达特点及其与淋巴结转移的关系〔J〕.昆明医学院学报，2006；27（5）：559.