丙泊酚对大鼠肺缺血再灌注损伤细胞凋亡及相关蛋白的影响

　　　　 作者：付笑飞 赵松 刘东雷 王建军

【摘要】 　　目的 探讨丙泊酚对大鼠肺缺血再灌注损伤（LIRI）细胞凋亡及相关蛋白的影响。方法 雄性SD大鼠42只，随机分为3组：假手术组(S组)、缺血再灌注组（IR组）、丙泊酚组（P组）。IR组、P组均建立大鼠原位肺缺血再灌注模型（缺血1 h，再灌3 h），P组于缺血前30 min静脉输注丙泊酚5 mg·kg-1·h-1。实验结束后立即取左肺标本，用免疫组化法检测Bcl2与Bax蛋白表达情况，原位细胞凋亡检测（TUNEL）法检测肺上皮细胞凋亡指数（AI），同时光镜下观察肺组织的病理学变化。结果 与S组相比，IR组凋亡指数增加，肺组织中Bcl2、Bax表达均增强，Bcl2/Bax比值明显降低 (P＜0.05)；与IR组相比，P组Bcl2蛋白表达增加、Bax蛋白表达减少和细胞凋亡指数降低(P＜0.05)，光镜下肺组织病理学变化明显轻于IR组。结论 丙泊酚对大鼠LIRI具有保护作用，其机制可能与调控Bcl2/Bax蛋白表达从而减轻肺细胞凋亡有关。

【关键词】 丙泊酚；肺缺血再灌注；凋亡

　　在肺缺血再灌注损伤（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）的过程中细胞凋亡是导致肺组织损伤的重要原因之一〔1〕。丙泊酚（propofol）是临床常用的静脉麻醉药，已有研究表明其对LIRI有一定的保护作用〔2〕，但其机制尚不完全清楚。本研究通过建立大鼠在体LIRI模型，观察丙泊酚对LIRI肺细胞凋亡及相关蛋白的影响，并探讨其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及实验动物

　　清洁级健康雄性SD大鼠42只，体重250～300 g（同济医学院动物饲养中心提供）。主要试剂：鼠抗Bcl2、Bax抗体（Santa Cruz公司，美国）、原位细胞凋亡检测（TUNEL）试剂（Roche公司，德国）、二步法免疫组化检测试剂（PV6001）(北京中杉金桥生物科技有限公司)。主要药物：丙泊酚注射液（Astra Zeneca公司，意大利）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组及模型制备

　　实验动物随机分为3组，每组14只，分别为：假手术组(S组)，除不作缺血处理外，余同其他组；肺缺血再灌注组（IR组），缺血1 h，再灌3 h；丙泊酚组（P组），缺血前30 min静脉输注丙泊酚5 mg/kg·h-1，缺血1 h，再灌3 h。IR组和P组每组又分为两个亚组，再灌时间分别为1、3 h，每个亚组7只大鼠。

　　实验前4 h禁食，腹腔注射4%戊巴比妥50 mg/kg麻醉后，仰卧位固定。行颈部气管切开、插管，并游离右侧颈静脉和颈动脉。接动物呼吸机行机械通气维持呼吸，右侧经静脉插管、固定，接微量注射泵；然后左侧第5肋间开胸，钝、锐性结合游离左肺门。静息5 min后，于呼气末用无创血管夹阻断左左主支气管、左肺动脉和左肺静脉。阻断1 h后开放，进行再灌注1、3 h。于1、3 h实验结束时结扎肺门取出左肺待用。

　　1.2.2 肺组织Bcl2、Bax蛋白检测

　　采用二步免疫组织化学法（PV）法检测Bcl2、Bax蛋白的表达情况。各组标本用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，严格按照免疫组织化学试剂盒进行操作，阳性标准为细胞质染色呈棕色，阴性对照组用PBS代替一抗。在显微镜下观察，每张切片随机选取5个视野，使用MIAS2000图像分析系统分析阳性区域平均光密度值（OD），以OD值大小代表阳性产物表达的多少。

　　1.2.3 原位细胞凋亡检测
　　
　　用TUNEL法检测细胞凋亡情况。光镜下观察细胞核染为棕黄色为凋亡细胞。每例标本的切片随机选取5个高倍镜视野（40×10），按凋亡指数（AI）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%计算。

　　1.2.4 肺组织病理学检测

　　4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下（×200）进行观察。

　　1.3 统计学处理 数据均采用SPSS13.0软件分析，数据以x±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 肺组织Bcl2、Bax蛋白表达及Bcl2/Bax比值变化
　　与S组相比，IR组、P组肺组织Bcl2、Bax蛋白含量均明显增加（P<0.05）；与IR组相比，P组Bcl2蛋白表达明显增加，Bax表达减少（P<0.05），见表1。表1 再灌注后不同时相Bcl2、Bax蛋白（OD值）及Bcl2/Bax比值变化(略)

　　2.2 肺细胞凋亡指数（AI）变化

　　与S组相比，IR组、P组肺AI值均明显增加（P<0.05）；与IR组相比，P组各时相AI值减少，差异有统计学意义（P<0.05）。IR组、P组各组内各时相均以再灌注3h时AI值最高，见表2。表2 再灌注后不同时相肺细胞AI值变化(x±s)

　　2.3 肺组织病理学检查

　　光镜下观察HE染色病理切片，S组肺组织结构完好，肺泡腔完整，无明显渗出。水肿及炎性细胞浸润；IR组肺泡壁明显增厚，肺泡腔缩窄，可见大量炎症细胞浸润；P组肺组织病理改变较IR组轻，表现为肺泡壁轻度水肿及增厚，肺泡内可见中性粒细胞浸润。

　　3 讨 论

　　LIRI可发生于多种临床情况，是肺移植早期和心肺转流术后肺功能障碍的重要原因之一，而在LIRI发生过程中，由于细胞内活性氧增加、钙稳态失调及持续的低pH等多种诱因，导致肺泡上皮细胞凋亡从而使肺功能受损。研究表明，Bcl2和Bax是细胞凋亡相关基因中的重要成员，Bcl2是主要的抑凋亡基因，它主要通过阻止线粒体内细胞色素C的释放、抑制caspase3激活来阻止细胞凋亡〔3〕；Bax是Bcl2的同源体，其作用是通过抑制Bcl2来促进细胞凋亡〔4〕，Bcl2/Bax的比例关系与细胞凋亡的调控密切相关〔5〕。本研究中观察到IR组、P组肺细胞AI值与S组相比明显增加（P<0.05），证实了细胞凋亡在LIRI中起到重要作用。与IR组相比，P组可明显增强肺组织Bcl2蛋白的表达，降低Bax蛋白的表达，使Bcl2/Bax比值增加而细胞凋亡指数降低，说明丙泊酚可能是通过调节Bcl2/Bax途径来抑制LIRI。
　　
　　丙泊酚是一种新型的酚类静脉麻醉药，其化学成分为2，6二异丙基酚，大量研究显示其对缺血再灌注损伤有一定的保护作用，这种作用可能与其清除自由基的抗氧化作用有关〔6〕。本研究中病理切片观察到给予丙泊酚后肺组织水肿及炎性渗出较IR组明显减轻，说明丙泊酚可以通过减轻肺水肿起到对肺组织缺血再灌注损伤的保护作用，这与徐咏梅等〔2〕的研究结论相一致。此外丙泊酚还可以通过调节细胞内钙离子平衡起到抗凋亡的作用〔7〕。

参考文献

　　1 Cobelens PM，Putte BP，Kavelaars A，et al.Inflammatory consequences of lung ischemiareperfusion injury and lowpressure ventilation〔J〕.J Surg Res，2009；153(2)：295 301.

　　2 徐咏梅，薄玉龙，吕湘琪，等.丙泊酚对大鼠肺缺血再灌注损伤的影响〔J〕.临床麻醉学杂志，2007；23(9):7568.

　　3 Park SE，Park C，Kim SH，et al.Korean red ginseng extract induces apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells〔J〕.J Ethnopharmacol，2009；121(2):30412.

　　4 Garcia EJ，Lawson D，Cotsonis G，et al.Hepatocellular carcinoma and markers of apoptosis (Bcl2，Bax，Bclx)：prognostic significance〔J〕. Applied Immunohistochem Mol Morphol，2002；10(3):2107.

　　5 Huang YC，Chuang LY，Hung WC.Mechanisms underlying nonsteroidal anti inflammatory druginduced p27 (Kip1) expression〔J〕.Mol Pharmacol，2002；62(6)：151521.
　　
　　6 Chen L，Gong Q，Xiao C.Effects of propofol，midazolam and thiopental sodium on outcome and amino acids accumulation in focal cerebral ischemiareperfusion in rats〔J〕.Chin Med J，2003；116(2)：2926.

　　7 曹江北，李云峰，米卫东，等.丙泊酚对细胞内钙离子的调节〔J〕.国外医学·药学分册，2002；19(5)：2936