乙醛脱氢酶2基因多态性与老年冠心脏病的相关性

【摘要】 　　目的 探讨乙醛脱氢酶2(ALDh3)基因G487A多态性与老年冠状动脉粥样硬化性心病(CHD)患者的关系。方法 320例行冠状动脉造影的老年患者，根据造影结果分为CHD组169例和非CHD组(对照组)151例，利用多聚酶链反应技术，检测ALDh3基因G487A多态性。结果 基因型频率符合HardyWeinberg平衡；CHD组AA+AG基因型(ALDh3*2/*2+ALDh3*1/*2) 频率明显高于GG型(ALDh3*1/*1)组，与对照组有显著性差异(P=0.011)；Logistic回归分析显示，A等位基因、低HDLC增加了CHD的危险，A等位基因、低HDLC对CHD的发生有协同作用。结论 ALDh3基因G487A多态性与老年冠心病的发病有关，A等位基因可能是CHD发病的遗传危险因素之一。

【关键词】 冠状动脉疾病；基因；多态性，单核苷酸；乙醛脱氢酶2；聚合酶链反应

　　冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）是目前危及人类生命的最主要疾病之一，其发病机制与斑块破裂和血栓形成有关。近年来研究发现〔1，2〕乙醛脱氢酶2（ALDh3）基因亦参与了CHD的发生发展过程。人类ALDh3基因第487位碱基有一个突变位点，出现碱基置换：鸟嘌呤（G）→腺嘌呤（A），导致该基因表达蛋白的谷氨酸（Glu）替换为赖氨酸（Lys）。故ALDh3基因型在人群中有三种组合方式，GG型：ALDh3*1/1；AG型：ALDh3*1/2；AA型：ALDh3*2/2。日本有两项研究初步探讨了ALDh3基因多态性与CHD的关系，但结论似乎矛盾。一项研究提示ALDh3基因AA型有抗动脉粥样硬化(AS)作用〔1〕。而另一项研究报道ALDh3基因AA型是CHD的危险因素，其可能通过引起高密度脂蛋白(HDLC)浓度下降而致CHD发生〔2〕。在中国ALDh3基因与老年人CHD、AS关系如何，尚未见报道。而且，ALDh3 G487A多态性的等位基因频率在不同种族、地区分布存在明显差异性〔3〕，故有必要探讨ALDh3基因G487A多态性与老年CHD发病之间的关系，这对指导AS和CHD的防治具有重要意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　选择2006年12月至2008年8月本院收治老年患者320例。CHD组169例〔心肌梗死（MI）122例〕，男102例，女67例，年龄61～76岁，平均(67.06±4.10)岁，诊断符合WHO诊断标准，均行选择性冠状动脉造影术(QCA)证实冠状动脉病变的存在，以左主干、前降支、回旋支、右冠状动脉或其主要分支狭窄中至少有一支狭窄≥50%为阳性。非CHD患者(对照组)151例，男94例，女57例，年龄61～78岁，平均(67.37±5.16)岁，经检查左心室功能正常，无CHD的客观证据，冠状动脉造影结果正常。伴有感染、肿瘤、糖尿病、全身免疫性疾病、严重肝肾疾病者除外。所有研究对象均来自济南地区汉族人群，无血缘关系，均于入院后2～5 d行冠状动脉造影。

　　1.2 主要试剂

　　血液基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于TIANGEN公司；PCR引物由济南博亚生物技术有限公司合成；Ficoll淋巴细胞分离液为TBD生物制品科技有限公司产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 病例资料收集

　　均于入院后24 h内询问并采集，包括性别、年龄、身高、体重、血压等，计算体重指数，所有患者抽血前1 d晚餐进食普通饮食，并禁食12 h，清晨6：00～7：00时平卧位休息至少30 min后，采集外周静脉血进行血脂、纤维蛋白原等检测，留取部分静脉血-80℃冰箱保存备用。

　　1.3.2 基因型的检测

　　取静脉血2 ml，枸橼酸钠抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞，使用基因组DNA提取试剂盒提取DNA。目的DNA片段扩增引物：上游引物5′GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG3′，下游引物5′CCACCAGCAGA CCCTCAAG3′。反应体系50 μl，模板DNA 2 μg，2×Master Mix 25 μl，引物各2 μl，双蒸水补足至50 μl。反应条件：94℃预变性3 min后进入循环：94℃变性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR扩增产物为200 bp。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，溴乙啶染色，紫外线分析凝胶成像系统下观察电泳结果。将目标条带切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将PCR产物纯化，由济南博亚生物技术有限公司提供目的基因片段测序。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS13.0统计软件，所有计量资料数据以x±s表示，组间比较行t检验，计数资料以频数表示，组间比较行χ2检验，Logistic回归分析CHD的危险因素。

　　2 结果

　　2.1 ALDh3基因测序结果

　　经人工读取测序结果，ALDh3基因型有3种：AA型，GG型和AG型。见图1。

　　2.2 两组一般资料比较

　　CHD组的HDLC水平低于对照组(P<0.05)，其余各项水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 两组一般资料比较(略)

　　2.3 基因型及等位基因频率分布

　　两组基因型分布均符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)。CHD组AA+AG基因型频率明显低于GG基因型，与对照组比较差异有显著性意义(χ2=6.418，P=0.021)；G、A等位基因在CHD组、对照组的分布差异有显著性意义(χ2=6.414，P=0.011)。见表2。表2 两组ALDh3基因型及等位基因的分布和频率(略)

　　2.4 危险因素分析

　　以是否发生CHD为因变量做Logistic回归，在调整多种混杂因素后，A等位基因和HDLC均影响CHD发病的危险性(A等位基因:P=0.005，OR=2.426，95%CI:1.312～4.526;HDLC:P=0.007，OR=2.286，95%CI:1.249～4.182)，A等位基因与低HDLC对于CHD发病具有一定的协同作用(P=0.000，OR=3.015，95%CI:1.693～5.371)。A等位基因影响CHD(P=0.028，OR=2.419，95%CI:1.103～5.309)和MI(P=0.010，OR=2.663，95% CI:1.260～5.628)的发生，HDLC则主要作用于MI患者(P=0.021，OR=2.445，95%CI:1.114～5.225)。

　　3 讨论
　　
　　人类乙醛脱氢酶（ALDH）是一种四联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。目前已发现ALDH有19种同工酶，主要有ALDH1～4四种，由位于四个不同染色体的独立基因位点编码〔4〕，ALDh3基因位于染色体上12q24。由于ALDh3基因存在G487A多态性，所以有两个等位基因，其中具有催化活性的野生型称为：G等位基因（ALDh3*1），催化能力失活的变异型称为：A等位基因（ALDh3*2）。
　　
　　日本学者Takagi等〔2〕报道日本人群中ALDh3基因AA型是CHD的危险因素。他们发现CHD发病率、饮酒量和HDLC浓度在三个基因型组间有显著差异，Logistic多因素回归分析表明HDLC自变量会降低AA型者患MI的风险，饮酒量会减弱ALDh3基因型与HDLC间的关联性，故他们推测AA型可能通过影响饮酒量引起HDLC浓度下降而致MI。本研究中ALDh3是酒精代谢中的一个关键酶，携带ALDh3A等位基因者由于体内ALDh3酶活性下降或缺失，饮酒后乙醛浓度增加会引起不良反应，故携带ALDh3A等位基因的人饮酒量通常会较低。目前已证实适量饮酒能通过影响HDLC、糖化血红蛋白、纤维蛋白原对心血管起保护作用〔5〕，饮酒量的减少是否会通过影响这三个因素成为CHD的危险因素目前尚未知晓。本研究在调整混杂因素后，AA+AG基因型患CHD危险性是GG型的2.426倍，提示A等位基因可能是CHD的独立危险因素之一，这与Takagi等〔2〕的研究结果一致。综上所述ALDh3基因G487A多态性与CHD发生有关，但由于各研究人群的种族、地域以及样本数量存在差异，究竟是A还是G等位基因影响CHD的发生，结果尚不一致。
　　
　　回归分析显示，ALDh3基因G487A多态性与低HDLC有明显的协同作用。有研究表明ALDh3在肝、肾、心脏中有较高表达，它与生物氧化有密切关系〔6〕。在缺氧心肌中ALDh3基因下调，ALDh3对氧化刺激导致的神经细胞、内皮细胞损伤有明显的拮抗作用〔7，8〕。魁北克心血管研究证实，HDL水平每降低10%，发生CHD的危险增加13%〔9〕，HDL与MI、脑卒中、猝死、冠状动脉成形术后再狭窄、严重的早发CHD的发生高度相关〔10〕。已知HDL有多种抗AS功能，其最重要的抗AS功能是HDL能与血管壁上细胞发生交互作用从而能使血管壁上多余的胆固醇逆向转运至肝脏，通过肝脏的处理胆固醇可变成胆酸盐〔11〕。HDL还具有许多其他抗AS功能:逆转内皮细胞功能失调，刺激前列环素(具有扩张血管、抗栓作用)产生，抑制内皮细胞凋亡及血小板聚集性，同时还能抑制低密度脂蛋白氧化〔12〕。多元回归显示，低HDLC仅升高MI的发病率，可能是由于将MI由CHD分离出来后，样本含量的改变所致偏倚作用的结果。
　　
　　本研究结果显示，A等位基因的存在升高了CHD发生的危险性，而且它与低HDLC在影响冠心病发生危险性方面有协同作用，ALDh3基因G487A多态性有可能成为老年CHD发生的独立危险因素。

参考文献

　　1 Narita M，Kitagawa K，Nagai Y，et al.Effects of aldehyde dehydrogenase on carotid atherosclerosis〔J〕.Ultrasound Med Biol，2003；29(10):14159.

　　2 Takagi S，Iwai N，Yamauchi R，et al.Aldehyde dehydrogenase 2 gene is a risk factor for myocardial infarction in Japanese men〔J〕.Hypertens Res，2002；25(5):67781.

　　3 Grabb DW.Biological markers for increased risk of alcoholism and for quantitation of alcohol consumption〔J〕.J Invest，1990；85(4):3115.

　　4 Vasiliou V，Nebert DW.Analysis and update of the human aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene family〔J〕.Hum Genomics，2005；2(2):13843.

　　5 Freiberg MS，Samet JH.Alcohol and coronary heart disease：the answer awaits a randomized control trial〔J〕.Circulation，2005；112(10):137981.

　　6 Greenberg AK，Basu S，Hu J，et al.Selective p38 activation of cJun Nterminal kinase promotes survival of cardiac myocytes after oxidative stress〔J〕.Biochem J，2002；362(Pt3):56171.

　　7 Ohsawa I，Nishimaki K，Yasuda，et al.Deficiency in a mitochondrial aldehydedehydrogenase increases vulnerability to oxidative stress in PC12 cells〔J〕.J Neurochem，2003；84(5):11107.

　　8 Chen ZQ，Zhang J，Stamler JS，et al.From the cover:identification of the enzymatic mechanism of nitroglycerin bioactivation〔J〕.Proc Natl Acad Sci(PNAS)，2002；99(12)：830611.

　　9 Shaul PW，Mineo C.HDL action on the vascular wall:is the answer NO〔J〕.J Clin Invest，2004；113(4):50913.

　　10 Weverling RI，Jijnsburger AW，Jonkers IJ，et al. High density vs lowdensity lipoprotein cholestrol as the risk factor for coronary artery disease and stroke in old age〔J〕.Arch Intern Med，2003；163(6):154954.

　　11 Toth PP.Reverse cholesterol transport highdensity lipoprotein′s mgnificent mile〔J〕.Cuur Arteriosclerosis Rep，2003；5(2):38693.

　　12 Nofer J，Kehrel B，Fobker M，et al.HDL and arteriosclerosis:beyond reverse cholesterol transport〔J〕.Atherosclerosis，2002；161(11):116.