Klotho蛋白对C57BL/6小鼠黑质神经元数目的影响

　　　　 作者：期杜洪霞 周芳 张湛睿 李新华 弥曼

【摘要】 　　目的 观察Klotho蛋白对C57BL/6小鼠黑质神经元数目的影响并探讨其可能机制。方法 C57BL/6小鼠分3组：野生型雄性小鼠（WT），Klotho基因过表达型（Tg）小鼠，Klotho基因敲除鼠（KO）各6只，行为学观察及体重测定，用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学法观察黑质神经元的变化。结果 KO小鼠与WT、Tg组小鼠相比体重明显降低（P<0.01）。WT组小鼠与Tg组小鼠相比体重差别不显著（P>0.05）；与WT小鼠相比KO组小鼠脑黑质神经原数目上调而Tg组小鼠脑黑质神经原数目下调，三组间均有显著性差异（P<0.01）。结论 Klotho基因可影响黑质纹状体内多巴胺能神经元的数目。与WT组小鼠相比KO小鼠脑黑质神经原数目上调而Tg小鼠脑黑质神经原数目下调，可能是KlothoFGF23共受体存在负反馈调节机制的影响。

【关键词】 Klotho蛋白；多巴胺能神经元；黑质

　　Klotho蛋白与人类衰老密切相关〔1〕，该蛋白缺陷鼠可出现一系列与人类衰老相似的多种行为和病理变化：寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、骨质疏松、肺气肿和免疫功能降低等；基因敲除小鼠的步态异常，平均步长明显缩短，类似人类帕金森病（PD）患者的步态；使用一定的方法使小鼠重新获得基因，上述各种症状均能缓解〔2〕。研究人员应用基因技术培育出的Klotho基因蛋白水平是正常小鼠2～2.5倍的实验小鼠，结果证实这种小鼠的生存寿命要比正常野生型小鼠延长20%～30%〔3〕。Klotho蛋白对MPTP诱致PD模型小鼠具有神经保护作用〔4〕，本实验将研究Klotho基因对C57BL/6小鼠黑质神经元数目的影响并探讨其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器

　　MPTP购自美国Sigma公司；酪氨酸羟化酶（TH）抗体购自美国Protos Biotech公司；TH免疫组化试剂盒、DAB试剂购自美国Vector Laboratories公司。

　　1.2 动物分组

　　C57BL/6野生型（wild type，WT）雄性小鼠，Klotho基因过表达型（Klotho overexpressing，Tg）小鼠，Klotho基因敲除（Klotho knockout，KO）鼠各6只，8～10周龄，由美国西南医学中心病理学系饲养并提供。在18～20℃的室温和相对湿度为50%～60%的昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食，人工昼夜节律（12～12 h）。

　　1.3 行为学观察及体重测定

　　观察各组小鼠的外观、表型及行为学异同。包括：皮肤正常或萎缩、变薄、毛囊数量减少；自发活动增加、减少、蹿跑、蜷缩不动、活动减少和步态紊乱；体毛正常或稀少；肌肉运动增强、减弱、失调、震颤、抽搐、麻痹、共济失调；消瘦、懒动和驼背。并测各组小鼠体重。

　　1.4 TH免疫组织化学染色

　　1.4.1 取材及冰冻切片

　　小鼠断头取脑组织，入含50 mg/ml多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲固定液（PBS）中，4℃固定6 h，再入含250 g/L蔗糖的PBS溶液内4℃过夜至脑组织块沉入瓶底。于冠状黑质平面将脑组织块连续冰冻切片，片厚30 μm。所切连贯切片按序号保存于PBS液内，每只鼠所得黑质致密部（SNc）切片中隔5取1共取5张连贯切片进行TH免疫组织化学染色。各组切片选取部位尽量一致。

　　1.4.2 TH染色

　　切片置入0.1 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3次每次10 min；PBS+h3O2（2∶1）冲洗30 min；0.1 mol/L PBS冲洗3次每次10 min；切片入滴加血清3滴10 ml PBS溶液中孵育30 min；加一抗(1∶４ 000，用抗体稀释液稀释) ，并于湿盒内4℃过夜；第2天PBS冲洗3次，每次10 min；滴加生物素标记的二抗工作液，孵育30 min；PBS冲洗3次，每次10 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，孵育1 h；PBS冲洗3次每次10 min；Acetate缓冲液冲洗10 min；DAB显色４～5 min；Acetate缓冲液冲洗10 min，PBS冲洗3次，每次10 min；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后镜下观察并照相。DAB显色液中加入Nickel，阳性细胞为细胞质和突起着蓝色。

　　1.4.3 阳性细胞计数

　　应用StereoInvestigator软件，对照图谱，在低倍视野下勾出SNc边界〔5〕，选定计数范围，高倍视野下计数设定选取框内阳性细胞数，顺序由左至右，由上至下，不完全位于视野内的细胞不计数；分析TH阳性细胞计数结果，统计每只鼠每张切片的细胞总数和黑质的细胞总数。系统误差由软件统计，要求小于等于0.06。
　　
　　1.5 统计学处理

　　数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组小鼠行为学和表型观察

　　Tg组小鼠和WT组小鼠外观和表型、活动未见明显异常。KO组小鼠外观较Tg和WT组小鼠明显消瘦，伴有驼背、体毛稀少。可观察到KO组小鼠较Tg和WT组小鼠皮肤变薄、萎缩，皮肤毛囊数量减少。KO组小鼠明显懒动，自发活动减少显著，还可见到步态紊乱、运动失调。行为学和表型观察说明Klotho基因敲除鼠的生长发育阻滞、活动减少、步态紊乱，出现表型异常的特性。

　　2.2 Klotho蛋白对各组小鼠体重的影响

　　WT组小鼠（21 g）与Tg组（22 g）小鼠体重无明显差别（P>0.05）。与WT组和Tg组小鼠相比，KO组小鼠体重（13 g）明显降低（P<0.01）。结合行为学改变，说明KO组小鼠较Tg组和WT组小鼠表型明显异常，表现为自发活动减少、懒动、运动失调、消瘦、驼背、体毛稀少、体重明显减轻，行为学出现退行性变化。

　　2.3 各组小鼠黑质神经元数目的比较
　　
　　KO组小鼠在中脑腹侧的SNc可见许多TH阳性神经元和纤维，细胞较大，多为椭圆形和三角形，细胞质内蓝色颗粒浓密，染色较深。Tg组小鼠SNc TH阳性神经元减少，TH阳性纤维和胞体较KO少，TH阳性神经元数量减少，细胞质内蓝色颗粒较KO组少，染色颜色最浅。WT组小鼠SNc 的TH 免疫阳性细胞染色介于其他两组之间。见图1。与WT组小鼠SNc区TH 免疫阳性细胞数（5 457±228）比较，KO组明显上调（6 404±219）（P<0.01），而Tg组明显下降（4 525±170）（P<0.01）；KO组和Tg组小鼠脑黑质神经元数目亦有显著差异（P<0.01）。说明Klotho基因可以调节小鼠脑黑质神经元的数目。

　　3 讨 论

　　已发现Klotho蛋白对PD模型小鼠具有神经保护作用，但是却发现Klotho基因高表达型小鼠的脑黑质神经原数目比野生型的少〔3〕。本文行为学和表型观察显示Klotho基因敲除鼠的生长发育阻滞、活动减少、步态紊乱，出现表型异常的特性，这与文献报道Klotho基因敲除后小鼠出现多种与人类衰老相关的行为和病理生理改变及表型异常是相符的。Masuda〔6〕证实Klotho基因敲除鼠从出生第4周起出现生长发育迟滞，并有动脉硬化、生殖器官萎缩、肺气肿等与衰老相关的组织学改变。三组小鼠脑黑质神经原数目具有显著性差异，与WT组相比较，Tg组小鼠脑黑质神经原数目减少，而KO组小鼠脑黑质神经原数目增多。

　　Klotho蛋白是一种主要的成纤维细胞生长因子（FGF）23结合蛋白，与FGF23的功能密切相关，是决定生长因子受体的配体特异性膜蛋白〔7〕。Klotho蛋白不仅在衰老的控制中有着重要地位，而且与众多疾病的发生发展密切相关〔8〕。FGF是一种多功能非特异性活性物质，FGF是一类能与细胞膜特异性受体结合从而发挥作用并调节细胞生长的肽类分子。对内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等多种中胚层和神经外胚层来源的细胞有促进DNA合成和促细胞分裂作用，还可延缓细胞系衰老。FGF23是FGF家族最新的成员，是一种分泌性蛋白质，在肾脏中表达，是与维生素D和磷酸盐新陈代谢有关的关键酶〔9〕。FGF信号途径通过酪氨酸激酶膜受体调节细胞生长、分化和细胞死亡等多种细胞过程。通过基因剔除技术获得的FGF23小鼠与Klotho基因缺陷小鼠的衰老表型相似，都出现了骨骼发育不良、骨质疏松、肌肉老化等〔10〕。

　　Klotho蛋白可能通过与FGF类型受体（FGFR）1共同构成了FGF23受体介导FGF23的信号转导，最新研究显示〔11〕，Klotho家族中新成员βKlotho可与FGFR结合，是FGF19和FGF21信号转导中其受体的辅助因子，调节内分泌和组织的新陈代谢。我们推测Klotho还可能通过调节FGF23、FGF19、FGF21信号转导，从不同方面、不同途径调节细胞生长和分化。

　　在对FGF23自身的表达调节研究中发现FGF23受到反馈调节机制的影响。血磷浓度升高能使骨骼中FGF23的表达增强，随之FGF23 能作用于肾脏靶细胞，通过KlothoFGFR1共受体的介导从而抑制1а羟化酶的表达与活性，导致磷的重吸收减少；相反若血磷的浓度降低则同时可以导致血清中的FGF23浓度也随之降低，这个精密的反馈机制体现了机体稳定的血磷环境与正常的物质代谢过程。

　　因为Klotho基因与FGF23的功能密切相关，故而我们推测KlothoFGF23共受体也存在负反馈调节机制的影响。可能由于受到KlothoFGF23共受体负反馈调节机制的影响，Klotho基因过表达小鼠脑黑质神经原数目较野生型小鼠脑黑质神经原数目减少；Klotho基因敲除小鼠脑黑质神经原数目反而较野生型小鼠数目上调。这个负反馈机制可能通过Klotho调节FGF23、FGF19、FGF21的信号转导，从不同的方面、不同的途径来发挥作用，对黑质DA能神经元具有调节作用。

　　在实验中我们证实Klotho基因高表达引起小鼠脑黑质神经原数目上调，而Klotho基因敲除引起小鼠脑黑质神经原数目下调。但Klotho基因高表达又表现出对PD的保护作用，提示神经元的组织学变化不能直接代表神经元的功能变化，可能神经元发生了某些结构或活性的变化，其机制尚待深入研究。

参考文献

　　1 KuroO M，Matsumura Y，Aizawa H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕.Nature，1997；390:4551.

　　2 Jenner P.Oxidative stress in Parkinson′s disease〔J〕.Ann Neurol，2003；53(Suppl3):S2636.

　　3 Kurosu H，Yamamoto M，Jeremy D，et al.Suppression of aging in mice by the hormone Klotho〔J〕.Science，2005；309：182933.

　　4 杜洪霞，张湛睿，弥 曼.Klotho蛋白对帕金森病模型小鼠的神经保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(17):21903.

　　5 German DC，Nelson EL，Liang CL，et al.The neurotoxin MPTP causes degeneration of specific nucleus A8，A9 and A10 dopaminergic neurons in the mouse〔J〕.Neurodegeneration，1996；5:299312.

　　6 Masuda H，Chikuda H，Suga T，et al.Regulation of multiple ageinglike phenotypes by inducible klotho gene expression in klotho mutant mice〔J〕. Mech Ageing Dev，2005;126（12）:127483.

　　7 Urakawa I，Yamazaki Y，Shimada T，et al.Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23〔J〕.Nature，2006；444:7704.

　　8 Kurosu H，Yamamoto M，Clark JD，et al.Suppression of aging in mice by the hormone Klotho〔J〕.Science，2005；309:182933.

　　9 Kurosu H，KuroO M.The Klotho gene family and the endocrine fibroblast growth factors〔J〕.Curr Opin Nephrol Hypertens，2008;17:36872.

　　10 Kurosu H，Ogawa Y，Miyoshi M，et al.Regulation of fibroblast growth factor23 signaling by klotho〔J〕.J Biol Chem，2006；281:61203.

　　11 Kurosu H，KuroOM.The Klotho gene family as a regulator of endocrine fibroblast growth factors〔J〕.Mol Cell Endocrinol，2009；299（1）:728.