CYP1A1基因多态性

　　　　作者：刘芳 孙黎 杨翠军 李华 刘开扬

【摘要】 目的 探讨张家口地区健康人群CYP1A1基因MspI和Ile/Val的多态性。方法 采用等位基因特异性扩增和PCR限制性片段长度多态性（RFLP）技术，分析360例张家口地区健康成人的CYP1A1基因3′端限制性内切酶MspI位点和Exon7位点的3种基因型的分布规律。结果 张家口健康人群MspI基因型m1m1占35.8%，基因型m1m2占50.2%，基因型m2m2占14.0%，等位基因m1m2分别为60.9%，39.1%。Ile/Val多态性，其Ile及Val等位基因的频率分别为68.5%，31.5%。Ile/Ile，Ile/ Val，Val/Val基因型分布频率分别为44.4%，48.1%，7.5%。结论 张家口地区健康人群CYP1A1基因存在MspI和Ile/Val的多态性。

【关键词】 CYP1A1；MspI；Ile/Val；基因多态性

　　CYP1A1是细胞色素P(CYP)450家族的一名成员，是体内重要的Ⅰ相解毒酶之一，参与多种内外源性化学物质体内代谢过程〔1〕。CYP1A1由CYP1A1基因编码，CYP1A1表达受基因控制和环境因素诱导，并存在种族和个体差异。主要分布于肺、肾、胃肠道、皮肤、胎盘等组织中，参与内源性和外源性化合物在体内代谢过程，主要通过氧化、还原、水解等作用，改变化合物所具有的功能基团。或使其分解。CYP1A1主要参与多环芳烃类化合物(PAH)的代谢，把其代谢为酚类物质活性很强的环氧化物，这些环氧化物在致癌、致突变中都有重要作用〔2，3〕。目前为止，已发现CYP1A1基因MSPI和Ile/Val多态在不同的种族、民族和地区的分布有很大差异。本试验采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)的技术，探讨张家口地区健康人群CYP1A1基因的MspI和Ile/Val多态性分布。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　随机选择360例无血缘关系的健康张家口地区人员，均在原籍稳定居住2代以上，年龄18～55岁。经张家口河北北方学院第一附属医院门诊查体健康，无遗传疾病的健康人群。其中男性186例，女性174例。

　　1.2 标本收集

　　从上述人群中每人抽取外周静脉全血3 ml，EDTA抗凝，-80℃保存待测。

　　1.3 基因组DNA的制备

　　DNA提取试剂盒提取DNA。

　　1.4 PCR反应

　　1.4.1 MspI基因型测定

　　采用等位基因特异性扩增方法PCRRFLP技术，MspI基因型测定所需引物，其序列为上游5′CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT3′，下游5′TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT3′。PCR的反应条件:反应总体积50 μl，含有200 μmol/L dNTP，上、下游引物各0.4 μmol/L，基因组DNA 0.4 μg，1 U TaqDNA聚合酶。在PCR仪上扩增，扩增参数：97℃预变性7 min，然后95℃，50 s，66℃复性50 s，72℃延伸1 min，30个循环后72℃延伸10 min。其PCR产物为340 bp的DNA片段。取10 μl PCR产物，加10 U MspI限制性内切酶，37℃水浴4 h，酶切产物经1.8%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳40 min，电压150 V，在紫外透射仪上观察结果。

　　1.4.2 Ile/Val多态性测定

　　采用等位基因特异性扩增方法PCRRFLP技术，分析Ile/Val多态性，引物序列：上游5CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAGC3′，下游5′TTCCACCCGTTGCAGCAGGATAGCC3′。反应体系同上，扩增参数：95℃预变性5 min，然后95℃，30 s，63.5℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环后72℃延伸7 min。其PCR产物为204 bp的DNA片段。取10 μl PCR产物，加10 U BsrD I限制性内切酶，25℃水浴24 h，酶切产物观察同上。

　　1.5 CYP1A1多态性

　　1.5.1 MspI基因型

　　扩增产物经酶切后分为3种基因型：没有MspI切割位点的等位基因m1的纯合子基因型m1m1(野生型)，可见340 bp一个片段；有MspI切割位点的等位基因m2的纯合子基因型m2m2(突变型)，可见200及140 bp 两个片段；m1和m2的杂合子基因型m1m2(杂合型)，可见340，200，140 bp 三个片段。

　　1.5.2 Ile/Val多态性

　　扩增产物经酶切后分为3种基因型：没有切割位点为纯合子基因型Ile/Ile(野生型)，可见204 bp一个片段；有BsrD I切割位点的等位基因Val/Val的纯合子基因型 (突变型)，可见65及139 bp两个片段；Ile/ Val (杂合型)，可见204，139，65 bp 三个片段。

　　　1.6 统计学方法

　　采用SPSS软件分析，用χ2检验法比较基因多态性等位基因频率的差异，检验群体基因型频率分布是否符合HardyWeinberg平衡定律。x

【摘要】 目的 探讨张家口地区健康人群CYP1A1基因MspI和Ile/Val的多态性。方法 采用等位基因特异性扩增和PCR限制性片段长度多态性（RFLP）技术，分析360例张家口地区健康成人的CYP1A1基因3′端限制性内切酶MspI位点和Exon7位点的3种基因型的分布规律。结果 张家口健康人群MspI基因型m1m1占35.8%，基因型m1m2占50.2%，基因型m2m2占14.0%，等位基因m1m2分别为60.9%，39.1%。Ile/Val多态性，其Ile及Val等位基因的频率分别为68.5%，31.5%。Ile/Ile，Ile/ Val，Val/Val基因型分布频率分别为44.4%，48.1%，7.5%。结论 张家口地区健康人群CYP1A1基因存在MspI和Ile/Val的多态性。

【关键词】 CYP1A1；MspI；Ile/Val；基因多态性

　　CYP1A1是细胞色素P(CYP)450家族的一名成员，是体内重要的Ⅰ相解毒酶之一，参与多种内外源性化学物质体内代谢过程〔1〕。CYP1A1由CYP1A1基因编码，CYP1A1表达受基因控制和环境因素诱导，并存在种族和个体差异。主要分布于肺、肾、胃肠道、皮肤、胎盘等组织中，参与内源性和外源性化合物在体内代谢过程，主要通过氧化、还原、水解等作用，改变化合物所具有的功能基团。或使其分解。CYP1A1主要参与多环芳烃类化合物(PAH)的代谢，把其代谢为酚类物质活性很强的环氧化物，这些环氧化物在致癌、致突变中都有重要作用〔2，3〕。目前为止，已发现CYP1A1基因MSPI和Ile/Val多态在不同的种族、民族和地区的分布有很大差异。本试验采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)的技术，探讨张家口地区健康人群CYP1A1基因的MspI和Ile/Val多态性分布。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　随机选择360例无血缘关系的健康张家口地区人员，均在原籍稳定居住2代以上，年龄18～55岁。经张家口河北北方学院第一附属医院门诊查体健康，无遗传疾病的健康人群。其中男性186例，女性174例。

　　1.2 标本收集

　　从上述人群中每人抽取外周静脉全血3 ml，EDTA抗凝，-80℃保存待测。

　　1.3 基因组DNA的制备

　　DNA提取试剂盒提取DNA。

　　1.4 PCR反应

　　1.4.1 MspI基因型测定

　　采用等位基因特异性扩增方法PCRRFLP技术，MspI基因型测定所需引物，其序列为上游5′CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT3′，下游5′TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT3′。PCR的反应条件:反应总体积50 μl，含有200 μmol/L dNTP，上、下游引物各0.4 μmol/L，基因组DNA 0.4 μg，1 U TaqDNA聚合酶。在PCR仪上扩增，扩增参数：97℃预变性7 min，然后95℃，50 s，66℃复性50 s，72℃延伸1 min，30个循环后72℃延伸10 min。其PCR产物为340 bp的DNA片段。取10 μl PCR产物，加10 U MspI限制性内切酶，37℃水浴4 h，酶切产物经1.8%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳40 min，电压150 V，在紫外透射仪上观察结果。

　　1.4.2 Ile/Val多态性测定

　　采用等位基因特异性扩增方法PCRRFLP技术，分析Ile/Val多态性，引物序列：上游5CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAGC3′，下游5′TTCCACCCGTTGCAGCAGGATAGCC3′。反应体系同上，扩增参数：95℃预变性5 min，然后95℃，30 s，63.5℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环后72℃延伸7 min。其PCR产物为204 bp的DNA片段。取10 μl PCR产物，加10 U BsrD I限制性内切酶，25℃水浴24 h，酶切产物观察同上。

　　1.5 CYP1A1多态性

　　1.5.1 MspI基因型

　　扩增产物经酶切后分为3种基因型：没有MspI切割位点的等位基因m1的纯合子基因型m1m1(野生型)，可见340 bp一个片段；有MspI切割位点的等位基因m2的纯合子基因型m2m2(突变型)，可见200及140 bp 两个片段；m1和m2的杂合子基因型m1m2(杂合型)，可见340，200，140 bp 三个片段。

　　1.5.2 Ile/Val多态性

　　扩增产物经酶切后分为3种基因型：没有切割位点为纯合子基因型Ile/Ile(野生型)，可见204 bp一个片段；有BsrD I切割位点的等位基因Val/Val的纯合子基因型 (突变型)，可见65及139 bp两个片段；Ile/ Val (杂合型)，可见204，139，65 bp 三个片段。

　　　1.6 统计学方法

　　采用SPSS软件分析，用χ2检验法比较基因多态性等位基因频率的差异，检验群体基因型频率分布是否符合HardyWeinberg平衡定律。

　　2 结 果

　　2.1 CYP1A1基因MspI多态分布

　　张家口地区健康人群该基因多态位点m1及m2等位基因的频率分别为60.9%，39.1%。m1m1，m1m2，m2m2基因型分布频率分别为35.8%，50.2%，14.0%。经χ2检验基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律(P>0.05)。

　　2.2 CYP1A1基因Ile/Val多态性

　　张家口地区健康人群该多态位点Ile及Val等位基因的频率分别为68.5%，31.5%。Ile/Ile，Ile/Val，Val/Val基因型分布频率分别为44.4%，48.1%，7.5%。经χ2检验基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　CYP1A1是细胞色素P450家族的一名成员，是外源性和内源性化合物在体内代谢的重要Ⅰ相酶之一〔4，5〕。其参与PAH如苯并芘的代谢，将其氧化为酚类产物和环氧化物。CYP1A1基因位于人类第15对染色体，有7个外显子和6个内含子。目前研究发现，亚洲人群CYP1A1基因在其DNA结构的3′端非翻译区6235位点T→C突变形成MspI酶切位点，即CYP1A1基因MspI多态性，突变基因可影响CYP1A1的诱导性〔6〕，研究发现CYP1A1的T6235C位点突变不但增加了酶的活性，而且提高了酶的诱导性。同时，CYP1A1基因MspI多态分布具有明显的地区和种族差异。Ile/Val多态性是由于第七外显子4 889 kb位置上的AG突变，导致酶蛋白水平表现为亮氨酸变成缬氨酸，ValIle多态性可被限制性内切酶BsrD Ⅰ识别，研究发现携带Ile/Val，Val /Val的病人比Ile/Ile病人在某些肿瘤疾病中表现出更大的危险性。本研究发现张家口地区正常人群CYP1A1基因呈多态性分布，为进一步研究张家口地区CYP1A1基因多态性与肿瘤等疾病的关系奠定了基础。

参考文献

　　1 Miyoshi Y，Takahashi Y，Egawa C，et al.Breast cancer risk associated with CYP1A1 genetic polymorphisms in Japanese women〔J〕.Breast J，2002；8(4):20.

　　2 Hayashi SI，Watanabe J，Nakachi K，et al.Genetic linkage of lung cancerassociated MspⅠpolymorphisms with amino acid replacement in the hemebinding region of the human cytochrome P450 1A1 gene〔J〕.J Biochem，1991；110(3):407.

　　3 Belogubova EV，Ulibina YM，Suvorova IK，et al.Combined CYP1A1/GSTM1 at risk genotypes are overrepresented in squamous cell lung carcinoma patients but underrepresented in elderly tumorfree subjects〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2006；132 (5)：32731.

　　4 李佳圆，龙启明.有机氯农药、CYP1A1易感基因型与乳腺癌的相互作用研究〔J〕.现代预防医学，2008；35 (1)：348.

　　5 Agundez JA.Cytochrome P450 gene polymorphism and cancer〔J〕.Curt Drug Metab，2004；5 (3)：21124.

　　6 尹 琴，常福厚，王敏杰，等.蒙古族与汉族学生CYP1A1基因多态性比较〔J〕.中国公共卫生，2009；25(9)：10534.