不同年龄小鼠脑组织中谷胱甘肽系统的比较

　　　　 作者：梁青宁 夏玉叶 盛雨辰 闵旸 蒋萍 季莉莉

【摘要】 　　目的 探讨不同年龄小鼠脑组织中谷胱甘肽(GSH)含量及相关酶活性的差异。方法 比较3，8和24周龄小鼠脑组织中GSH含量及GSH合成酶 (GCL)、GSH还原酶 (GR)、GSH过氧化物酶 (GSHPx) 和GSH巯基转移酶 (GST) 活性的差异。结果 不同年龄小鼠脑内GSH含量、GCL和GR活性无明显变化。8和24周龄小鼠脑内GSHPx明显低于3周龄组。24周龄小鼠脑内GST活力明显高于3和8周龄。结论 小鼠脑内GSH含量及其合成相关的GCL和GR活性不随年龄明显改变，而GSH依赖的抗氧化酶GST和GSHPx的活性则具有明显差异。

【关键词】 谷胱甘肽；谷胱甘肽合成酶；谷胱甘肽还原酶；谷胱甘肽过氧化物酶；谷胱甘肽巯基转移酶

　　【Abstract】Objective To investigate the difference of glutathione contents and the activities of glutathionerelated enzymes in mice brains of different age.Methods The mice were pided into 3 groups：3，8 and 24 weeks group respectively，and 10 mice in each group.The glutathione contents，and the activities of glutamate cysteine ligase (GCL)，glutathione reductase (GR)，glutathione peroxidase (GSHPx)，glutathioneStransferase (GST) were observed in mice brains of different age.Results There were no significant differences in glutathione contents，GCL and GR activities in brains between different age mice.However，the GSHPx activity was lower in 8 and 24 weeks group than that in 3 weeks group.The GST activity in 24 weeks group was higher than that in 3 and 8 weeks groups.Conclusions The glutathione contents and the activities of GCL and GR，which regulate cellular glutathione synthesis，do not change in mice brains with different age.However，there are significant differences in glutathionedependent antioxidant enzymes in mice brains of different age，such as GST and GSHPx.

　　【Key words】Age difference；Glutathione；GCL；GR；GSHPx；GST

　　衰老的过程伴随着机体氧化和还原能力的失衡。过量的活性氧自由基会损伤细胞内生物大分子DNA、蛋白质以及膜脂质等〔1〕，结果将会导致机体癌变、细胞增殖抑制、细胞死亡等〔2〕。有研究报道发现氧应激损伤是衰老相关的神经退行性疾病如早老性痴呆、帕金森病等主要的损伤机制〔3，4〕。谷胱甘肽(GSH)抗氧化系统是体内重要的防御系统，包括调控GSH含量的GSH合成酶 (GCL)和GSH还原酶 (GR)；以GSH作为底物清除过氧化物的GSH过氧化物酶 (GSHPx)和GSH巯基转移酶 (GST)。同时GST还与肿瘤的发生、肿瘤细胞耐药性、细胞凋亡以及心脑血管疾病有密切关系〔5〕。细胞内GSH以及GCL、GR、GSHPx、GST等构成的GSH相关抗氧化系统在维持细胞内还原性的环境和防御活性氧伤害中起重要作用。然而，目前并不知道这个完整的系统在脑中的含量及其具体功能，特别是在不同年龄状态下的含量差异及其对正常生理功能的影响。本文通过分析比较了3个不同年龄小鼠脑内GSH含量、GCL和GSH依赖的抗氧化酶的活性，从而初步揭示脑内GSH抗氧化系统随年龄变化的差异。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物、试剂与仪器

　　不同年龄ICR小鼠（3，8和24周龄）购自中科院，分成3组，分别是3、8和24周龄组，每组10只。GST活力测定试剂盒(南京建成)；GSH、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、5，5′二硫代双(2硝基苯甲酸)(DTNB)、GR以及其他未特殊标明的试剂均购自美国Sigma；BioTek Power Wave XS 酶标仪(Gene Company Limited)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DTNB法测定脑组织内GSH含量

　　小鼠脑组织在冰冷的加有偏磷酸的磷酸缓冲液中匀浆，4℃，10 000 r/min，离心10 min，吸取上清用于GSH含量的测定。反应体系由磷酸缓冲液(pH7.0)，EDTA，NADPH，GR酶，DTNB和样品组成，25℃反应30 min后在412 nm处测定吸光值，代入已测定的标准曲线中获得GSH含量。应用考马斯亮蓝法测定检测样品中的蛋白浓度，以小牛血清白蛋白(BSA)为标准。结果以GSH含量/mg蛋白表示。

　　1.2.2 GCL活性测定

　　小鼠脑组织在冰冷的PBS中匀浆，4℃，5 000 r/min，离心5 min，吸取上清用于GCL活力的测定。GCL活力测定

参考文献

〔6〕，同时测定样本中蛋白浓度。GCL活力表示为单位/mg蛋白，1单位的GCL活力等同于每分钟氧化1 mmol NADPH的量。
　　
　　1.2.3 GR活性测定

　　脑组织GR活性采用Carlberg (1989) 改良的NADPH法。小鼠脑组织在冰冷PBS中匀浆，4℃，5 000 r/min，离心5 min，吸取上清用于GR活力的测定，反应体系由磷酸钾缓冲液(pH7.3)、EDTA、GSSG、NADPH和上清样品组成，混匀测定340 nm处的吸光值，每隔1 min读数1次，连续测定5 min，获5个点的数据取平均值，再用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白浓度。结果计算如下：GR活力＝〔A340/min(样品)A340/min(空白)〕×稀释倍数/〔0.006 22×蛋白浓度(g/L)〕。

　　1.2.4 GSHPx活性测定

　　小鼠脑组织在冰冷PBS缓冲液中匀浆，4℃，2 000 r/min，离心10 min，吸取上清备用。GSHPx活力测定以GSH为反应底物，同时测定样本中蛋白浓度。根据组织蛋白浓度计算组织GSHPx活力，GSHPx活力表示为单位/mg蛋白，1单位的GSHPx活力等同于每分钟消耗1 mmol GSH量。

　　1.2.5 GST活性测定

　　小鼠脑组织在冰冷PBS缓冲液中匀浆，4℃，5 000 r/min，离心5 min，吸取上清用于GST活力的测定。用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白浓度，按试剂盒方法测定并计算GST活力。

　　1.3 统计学处理

　　数据以x±s表示，用SPSS11.0软件进行oneway ANOVA检验。

　　2 结 果

　　2.1 不同年龄小鼠脑组织中GSH含量和GSH合成相关酶活性的变化

　　3周龄组脑内GSH含量为（10.065±0.537）nmol/mg 蛋白；8周龄组为（10.120±0.376）nmol/mg蛋白；24周龄组为（9.334 ±0.276）nmol/mg蛋白。虽然24周龄小鼠脑内GSH含量有下降趋势，但与其他年龄小鼠相比无显著差异(P>0.05)。3周龄组脑内GCL的活力为〔（0.047±1.368）×10-3〕U/mg蛋白；8周龄组为〔（0.044±1.606)×10-3〕U/mg蛋白；24周龄组为〔（0.044±1.085）×10-3〕U/mg蛋白。虽然3周龄组有高于8和24周龄组的趋势，但不同年龄小鼠脑内GCL活力无显著差异(P>0.05)。3周龄组脑内GR的活力为（6.293±0.385）mU/mg蛋白；8周龄组（5.865±0.367）mU/mg蛋白；24周龄组（6.192 ±0.506）mU/mg蛋白。不同年龄间GR活力无显著差异(P>0.05)。

　　2.2 不同年龄小鼠脑组织中GSHPx活性变化

　　3周龄组脑内GSHPx活力为（4.573±0.248）U/mg蛋白；8周龄组为（3.784 ±0.198）U/mg蛋白；24周龄组为（3.767±0.270）U/mg蛋白。8和24周龄小鼠脑内SHPx活力均明显低于3周龄组(P<0.05)，而8和24周龄组间无显著差异(P>0.05)。说明随着增龄，脑内GSHPx抗氧化酶活性逐渐降低。

　　2.3 不同年龄小鼠脑组织中GST活性的变化

　　3周龄组脑内GST的活力为（173.907±10.364）U/mg蛋白；8周龄组为（183.278 ±8.133）U/mg蛋白；24周龄组为（227.383 ±17.127）U/mg蛋白。24周龄组小鼠脑内GST活力明显高于3周龄组(P<0.01)；同时24周龄组与8周龄组相比也有显著差异(P<0.05)，说明随着增龄，脑内GST活性会有显著增加。

　　3 讨 论

　　大量的实验数据表明老年动物对某些毒性物质比较敏感，在相同剂量的外来毒物之下比较容易产生毒性〔7〕。这可能是由于老年动物对某些毒性物质的解毒能力、解毒速度以及脑组织的修复能力、细胞增殖能力弱于成年和幼年〔8〕，其具体的机制目前还不是很清楚。机体内的氧化应激是导致脑部疾病的重要原因，有文献报道称脑卒中、脑血管意外、阿尔茨海默病，帕金森病等与衰老相关的疾病都与氧化应激有一定的关系〔3，4〕。GSH是脑组织内主要的抗氧化剂，正常生理状态下浓度高达2～3 mmol/L，在许多脑部疾病中具有重要的调控作用〔9〕。我们的实验结果发现脑内GSH含量及其相关的合成和再生成酶活力在不同年龄间无显著性差异。说明脑内GSH含量并没有随着年龄的增长发现明显的变化，同时其合成和再生相关的GCL和GR也没有明显的变化。

　　GSHPx是GSH系统中最为重要的抗氧化酶，它的缺失将导致机体抗氧化能力严重受损〔1〕。我们的结果显示，GSHPx活性随年龄增加而明显降低，说明随着衰老的进行，机体的抗氧化能力将严重受损，对应激将产生耐受。有研究表明GSHPx活性降低在脑部退行性疾病帕金森病等中发挥重要作用〔11〕，我们的结果提示随着年龄的增长而降低的GSHPx活性可能是帕金森病及其他神经退行性疾病发病的影响因素之一。

　　GST活性的增加与衰老相关的疾病，如肿瘤、心脑血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森病等的发病相关〔8，11〕。我们的结果提示随着年龄增长而增加的GST活力可能诱发了阿尔茨海默病、帕金森病等相关神经退行性疾病。同时年龄依赖的GST活性的改变可能也是老年动物脑内肿瘤以及脑血管疾病较幼年和成年易发的原因之一。

　　我们的实验结果表明了年龄依赖的GSHPx和GST抗氧化的变化情况，揭示其可能在神经退行性疾病中具有重要的作用，同时也提示我们在临床上使用对GSH系统有重要影响的药物时，应该考虑不同年龄之间抗氧化能力上的差异。对于年龄变化造成GSHPx和GST活性差异的具体分子机制有待进一步的研究。

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