细丝蛋白A在结直肠腺癌中的表达及临床意义

　　 作者：史建伟 刘会艳 王贵英 于跃明 王小玲 杨会钗 王士杰

【摘要】 　　目的 探讨细丝蛋白A（filamin A，FLNa）在结直肠腺癌中的表达及其生物学意义。方法 应用免疫组织化学方法检测60例结直肠腺癌患者的癌组织及正常组织中的FLNa表达情况，并结合临床资料进行分析。结果 FLNa在腺癌组织中的阳性表达率高于正常组织，其表达水平与肿瘤的TNM分期、肝转移、淋巴结转移及肠壁浸润深度相关。结论 FLNa的低表达在结直肠腺癌的发生发展中起重要作用。

【关键词】 结直肠肿瘤；细丝蛋白A；免疫组化学法

　　结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势〔1〕，且疗效并不乐观，近25年的结直肠癌5年生存率徘徊在50%～60%〔2〕。肿瘤的复发和远处转移是结直肠癌患者预后不良的主要原因。细丝蛋白A（filamin A，FLNa）属交联性肌动蛋白结合蛋白家族，参与细胞骨架的形成、形状改变及抵抗破坏性机械压力〔3〕，并调节细胞的增殖、迁移和侵袭〔4〕。因此推测FLNa在结直肠癌的形成和发展中具有重要作用。本研究应用免疫组织化学方法检测了FLNa在结直肠癌的常见类型——腺癌组织和结直肠正常组织中的表达情况，结合临床病理资料，探讨其与结直肠腺癌发生、浸润和转移的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例资料

　　随机选取60例蜡块标本，均来自河北医科大学第四医院外二科2009年1月～6月期间的手术切除标本。癌标本取自肿瘤中心处，正常组织标本取自距肿瘤边缘至少10 cm处。所有病例均经病理证实，无其他部位原发肿瘤，术前无化疗、放疗和免疫治疗史。

　　1.2 试剂和方法

　　采用免疫组织化学SP法，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人FLNa单克隆一抗购于Epitomics公司。二氨基联苯胺（DAB）显色剂购于TIANGEN公司。操作步骤严格按免疫组化试剂盒说明进行，以人子宫组织着色作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗进行染色作为阴性对照。

　　1.3 结果判断

　　FLNa定位于细胞质。在高倍镜下选择5个视野计数，每个高倍视野下计数200个细胞，计算出平均细胞阳性率。染色强度分为浅染、淡黄、棕黄和棕褐4个等级，颗粒状态又分为无明显颗粒、稀疏颗粒、一定量颗粒和弥漫性颗粒4种情况。综合分析每张切片的阳性率及染色强度，将免疫组织化学染色结果分为4级：阳性细胞数＜25%，染色较淡，未见明显颗粒者定为“-”；阳性细胞数≥25%～＜50%，染色淡，可见稀疏颗粒者定为“+”；阳性细胞数≥50%～＜75%，染色棕黄，可见一定量颗粒者定为“”；阳性细胞数≥75%，染色棕褐，可见弥漫性颗粒定为“”。由2名有经验的临床病理医师阅片，确定判定结果。

　　1.4 统计学分析

　　采用SPSS13.0统计软件，数据应用χ2检验或Fisher确切概率法，设检验水平α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 FLNa蛋白的表达

　　在60例标本中，FLNa蛋白在癌组织和正常组织中的阳性率分别为50%和91.67%，组间比较有显著差异（P=0.000）。见表1，图1。表1 FLNa的表达情况（略）

　　2.2 FLNa蛋白的表达与临床病理资料的关系

　　癌组织中FLNa蛋白的表达与性别、年龄、部位、肿瘤大小、分化程度、肉眼观形态和组织学类型无关（P＞0.05），与肿瘤的TNM分期、肝转移、淋巴结转移和肠壁浸润深度相关（P＜0.05）。见表2。表2 FLNa表达与临床病理资料的关系(略)

　　3 讨论
　　
　　FLN家族成员的共同点是具有连续串联的重复β折叠结构。FLNa基因结构高度保守，表达广泛，对哺乳动物的生长发育具有重要作用。FLNa蛋白二聚体亚基相对分子质量为280 kD、长度约为80 nm，包括氨基端的肌动蛋白结合结构域（ABD）和由24个串联的重复序列形成的棒状结构域，中间间隔两个分别含大约30个氨基酸残基形成的铰链结构。ABD为含有275个氨基酸残基的片段，包含多个连续的模体，这些模体最初在β血影蛋白、抗肌萎缩蛋白和α辅肌动蛋白中发现，后在其他肌动蛋白纤维结合蛋白中也发现该结构。含有大约96个氨基酸残基的重复序列具有类似免疫球蛋白样结构，重复序列具有良好的韧性，机械性信号通过棒状结构和“铰链”片段而进行传递〔5〕。两条多肽链在羧基端的第24个重复序列末端相连，形成与其功能有关的“V”型同源二聚体〔3〕。
　　
　　FLNa主要分布在细胞质，能够绑束纤维状肌动蛋白，诱使其形成强有力的立体肌动蛋白凝胶〔6〕。FLNa分子棒状结构域中的多重β片层结构为蛋白质蛋白质相互作用提供了界面，能够与多种具有重要功能的蛋白质相互作用，且多数蛋白质是细胞信号分子的膜受体， FLNa分子作为重要的信号转导支架蛋白而参与细胞增殖、黏附、迁徙等多种行为〔7〕。此外，FLNa还影响多种受体在细胞内的表达，干预多条与肿瘤形成有关的信号转导通路，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用〔8〕。
　　
　　目前尚不完全清楚FLNa影响肿瘤细胞侵袭力的机制。Zhu等〔9〕研究发现，FLNa通过Ras鸟嘌呤核苷酸释放因子1(GRF1)途径而调节Ras/胞外信号调节激酶(ERK)通路，下调细胞内基质金属蛋白酶9（MMP9）的水平，抑制了其对细胞外基质（ECM）的降解，阻遏肿瘤细胞的迁移。Fiori等〔10〕发现，与M2A7细胞（表达FLNa）相比，受表皮生长因子（EGF）刺激的M2细胞（缺失FLNa）中EGF受体酪氨酸的泛素化水平较低。进一步研究发现，FLNa的缺乏影响EGF受体与泛素连接酶cCb1链相互作用，细胞中抗EGF诱导的EGF受体降解受到显著的抵制，而在表达FLNa的细胞中EGF受体的降解却非常活跃，因此认为FLNa通过下调EGF受体的活性，抑制肿瘤细胞的增殖。Sasaki等〔11〕发现FLNa与Smads蛋白家族成员相互作用，调节转化生长因子β（TGFβ）信号，抑制肿瘤细胞的迁移，而在不表达FLNa的肿瘤细胞中则TGFβ信号缺失。此外，通过酵母双杂交实验以及肿瘤细胞信号转导通路的研究证实，FLNa能够特异性地与G蛋白耦联受体（多巴胺受体和钙受体）、小GTP结合蛋白（Rho，Rac和 CDC42）以及其效应分子（SEK1）结合，参与调节肿瘤的发生发展〔4〕。
　　
　　本实验癌组织的FLNa蛋白表达低于正常组，说明FLNa蛋白可抑制结直肠腺癌的发生，在病理状态下呈低表达，同时FLNa蛋白的表达水平与肿瘤的侵袭力呈负相关，对结直肠腺癌的侵袭转移具有阻遏作用，有望成为结直肠腺癌预后判断的新指标。

参考文献

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　　9 Zhu TN，He HJ，Kole S，et al.Filamin Amediated downregulation of the exchange factor rasGRF1 correlates with decreased matrix metalloproteinase9 expression in human melanoma cells〔J〕.J Biol Chem，2007;282(20)：1481626.

　　10 Fiori JL，Zhu TN，O′Connell MP，et al.Filamin a modulates kinase activation and intracellular trafficking of epidermal growth factor receptors in human melanoma cells〔J〕.Endocrinology，2009;150(6):255160.

　　11 Sasaki A，Masuda Y，Ohta Y，et al.Filamin associates with smads and regulates transforming growth factorβ signaling〔J〕.J Bio Chem，2001;276(21)：178717.