高脂喂养及罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌核呼吸因子1表达的影响

　　　　 作者：马慧娟 刘敬珍 宋光耀 高宇 王超

【摘要】 目的 观察高脂饮食和罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌核呼吸因子1（NRF1）表达及葡萄糖输注率的影响。方法 21～23月龄Wistar大鼠分为老年对照组、高脂组和高脂+罗格列酮干预组(干预组)，并设 4～5月龄Wistar大鼠作为青年对照组。应用正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术测得葡萄糖输注率，以评价胰岛素敏感性，高脂喂养第8周时，检测骨骼肌NRF1 mRNA表达。结果 高脂喂养8 w后青年对照组、老年对照组和高脂组空腹血游离脂肪酸、三酰甘油及骨骼肌三酰甘油均升高，葡萄糖输注率下降；经过罗格列酮干预后上述三组游离脂肪酸、三酰甘油及骨骼肌三酰甘油均明显下降，葡萄糖输注率升高。与青年对照组比较，老年对照组骨骼肌NRF1的表达下降，经高脂喂养后NRF1的表达进一步下降，干预组NRF1表达高于高脂组(P<0.01)，但仍比老年对照组的表达低(P<0.01)。结论 高脂饮食可诱导老年大鼠产生IR及骨骼肌 NRF1表达下降，罗格列酮可能调节骨骼肌NRF1的表达。

【关键词】 胰岛素抵抗；噻唑烷二酮类；NRF1

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of highfat diets and rosiglitazone treatment on the expression of NRF1 in skeletal muscle of aged rats， and to explore the role of NRF1 in skeletal muscle and insulin resistance(IR). Methods Male Wistar rats aged 21～23 months were randomly pided into old control (OC) ， highfat diet (HF) and highfat diet plus rosiglitazone treatment groups (RSG). Male Wistar rats aged 4～5 months were selected as young control group (YC). Insulin sensitivity was evaluated by hyperinsulinemiceuglycemic clamp technique at the end of the 4th and 8th week.The expression at mRNA and protein levels of PGC1α and Mfn2 in skeletal muscle were determined by polymerase chain reaction and Western blotting techniques. Results (1) After 8 weeks， the levels of free fatty acid，triglycerides and muscle triglycerides in YC， OC and HF groups were significantly higher and glucose infusion rates was significantly lower. The IR was induced successfully. The levels of fasting free fatty acid， triglycerides and muscle triglycerides in RSG group were significantly lower and glucose infusion rate was significantly higher than those in HF groups . (2) In skeletal muscle， the expression at mRNA and protein levels of NRF1 were decreased in OC group compared with those of YC group(P＜0.01).Compared with that of OC group， the expression of NRF1 was decreased significantly in HF group. The expression of NRF1was increased significantly in RSG group than that in HF group(P＜0.01). Conclusions The aged rats fed highfat diets could develop IR with decreased expression of NRF1 in skeletal muscle. Insulin sensitivity is improved with rosiglitazone treatment by increasing expression of NRF1 in skeletal muscle.

　　【Key words】 Insulin resistance ; Thiazolidinediones; NRF1

　　骨骼肌线粒体功能紊乱与胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病(T2DM)密切相关〔1〕，老年人易发生IR可能与肌肉细胞内线粒体作用减退或缺陷有关。国外研究发现T2DM患者骨骼肌核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF1)的表达下降，而有关NRF1在IR大鼠骨骼肌表达变化及其与胰岛素敏感性的关系，国内外鲜有报道。本课题组于2006年9月至 2007年6月观察了高脂饮食喂养老年大鼠NRF1的表达及胰岛素敏感性的变化，并应用罗格列酮进行干预，探讨骨骼肌NRF1的表达变化、线粒体功能与IR的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型及取材

　　21～23月龄清洁级健康老年雄性Wistar大鼠60只，体重500～550 g；4～5月龄大鼠20只，体重250～300 g，均购自河北医科大学实验动物中心（动物合格证号：604082）。所有大鼠自由饮水，室温20℃～24℃，相对湿度40％～70%，每日12 h光照维持，昼夜循环。所有实验动物适应性喂养2 w，老年大鼠随机分为老年对照组、高脂组和高脂+罗格列酮干预组(干预组)，每组20只；20只4～5月龄大鼠为青年对照组，每组均有2只大鼠机动。青年对照组和老年对照组给予基础饲料，热量组成:碳水化合物65.5%，脂肪 10.3%，蛋白质 24.2%；高脂组及干预组给予高脂饲料，其热量组成:碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白质20.1%。大鼠喂养4 w后，钳夹实验评价高脂组和干预组IR状态已形成。除干预组增加灌胃罗格列酮3 mg·kg-1·d-1外，其余各组喂养条件同前，继续喂养4 w后，钳夹实验再次评价各组IR状态。实验前取血用于生化指标的测定，实验结束后颈动脉放血处死，立即取大鼠股四头肌放入液氮，并转到-70℃低温保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 药物干预

　　干预组给予马来酸罗格列酮（葛兰素史克公司提供，药物批号05060018）蒸馏水混悬液3 mg·kg-1·d-1灌胃，对照组和高脂组给予等量蒸馏水灌胃，1次/d，共4 w。

　　1.2.2 正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术评价IR〔2〕

　　大鼠饲养至第4周和第8周，分别从每组随机选取大鼠6只，清醒状态下进行正常葡萄糖高胰岛素钳夹实验。在实验前4～5 d，给予戊巴比妥钠 60 mg/kg麻醉，右侧颈动脉和颈静脉插管，管腔内注入肝素抗凝，末端由实芯不锈钢针封闭，由皮下延伸到颈后并固定。经 4～5 d的术后恢复，使动物在清醒、自由活动下进行钳夹试验。术中胰岛素输注速度为4 mU·kg-1·min-1，葡萄糖浓度为30%。

　　1.2.3 血液和骨骼肌指标检测

　　血清血糖和三酰甘油采用酶法，骨骼肌三酰甘油经氯仿/甲醇抽提后采用Beckman Lx20全自动生化分析仪测定。血清游离脂肪酸采用铜显色法测定；血清胰岛素采用放射免疫法测定。

　　1.2.4 骨骼肌NRF1 mRNA的表达

　　采用Trizol一步法提取骨骼肌组织的总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度。各组取2 μg总RNA进行逆转录反应，然后分别以大鼠βactin和NRF1的特异性引物进行PCR反应。所用引物序列如下：NRF1上游5＇TCTCACCCTCCAAACCCAAC３＇，下游5＇CGCACCACATTCTCCAAAGG３＇。反应参数为：96℃预变性4 min，然后95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s反应30个循环，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行光密度分析。以βactin作为内参照，计算NRF1 mRNA表达的相对量。

　　1.2.5 骨骼肌NRF1蛋白表达

　　100 mg骨骼肌组织加入1 ml组织裂解液〔1% NP40，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L TrisHCl，pH7.5，10%甘油，1 mmol/L Na3VO4(钒酸钠)，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT〕中匀浆，冰浴30 min，使细胞充分裂解。4℃，8 000 r／min离心10 min，收集上清液，考马斯亮蓝法测定各样品的蛋白含量。各组样品分别取50 μg蛋白加入5×SDS上样缓冲液（0.1 mmol/L TrisHCl，pH6.8，2%甘油，0.1%溴酚蓝，10% β巯基乙醇，4% SDS）混合均匀，100℃ 沸水浴5 min使蛋白变性。冷却后以10% SDSPAGE电泳分离，然后电转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入400倍稀释的甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）、NRF1的特异性抗体（购自Santa Cruz公司），4℃孵育过夜。PVDF膜漂洗后加入5 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉金桥），孵育1 h，DAB显色。目的条带以凝胶成像分析系统进行光密度分析，GAPDH为内参照。

　　1.3 统计学分析

　　所有数据用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析，组间差异显著时进行两两比较。

　　2 结 果

　　2.1 一般项目比较

　　各组实验室检验结果见表1。表1 各组大鼠第8周末一般资料的比较(略)

　　2.2 正常葡萄糖高胰岛素钳夹实验

　　喂养第4周时进行钳夹实验，与青年对照组比较，老年对照组葡萄糖输注率下降(P<0.05)，高脂组下降更明显(P<0.01)，表明两组大鼠IR模型成功，高脂组与干预组差异无统计学意义。喂养第8周，老年对照组与青年对照组及高脂组比较，葡萄糖输注率改变更明显(P<0.01)，罗格列酮干预后，其葡萄糖输注率较高脂组明显升高(P<0.01)，见表2。表2 各组大鼠葡萄糖输注率的比较(略)

　　2.3 各组大鼠骨骼肌NRF1的mRNA和蛋白的表达

　　与青年对照组(2.98±0.31)比较，老年对照组骨骼肌NRF1 mRNA表达下降(2.12±0.24)，高脂组(0.94±0.09)进一步下降，差异有统计学意义(P<0.01)；罗格列酮干预组NRF1 mRNA表达(1.51±0.98)较高脂组升高，但仍低于老年对照组，组间差异有统计学意义(P<0.01)。同样，与青年对照组比较，老年对照组骨骼肌NRF1蛋白表达下降，高脂组进一步下降(均P＜0.01)，罗格列酮干预组NRF1蛋白表达较高脂组高，但低于老年对照组(P＜0.01)，见图1。

　　3 讨 论
　　
　　IR的发生随增龄呈增高趋势，环境因素可能是造成或加重IR重要原因。本研究结果显示，与青年对照大鼠比较，老年大鼠葡萄糖输注率降低，而在高脂喂养后，其葡萄糖输注率进一步下降，骨骼肌三酰甘油升高，提示增龄和环境因素可能均与IR有关。此外本实验中老年大鼠较青年对照大鼠的骨骼肌NRF1表达低，这可能与年龄有关。

　　线粒体作为半自主性的细胞器，不仅所需的大部分组分由核基因组编码，其DNA的表达也常处于核基因组的调控之下。NRF1就是一种调控线粒体DNA转录与复制的核调节因子，NRF1通过其DNA结合区结合并激活基因中的特定位点而启动转录，对呼吸链的表达以及线粒体DNA的转录与复制起重要的调节作用。本实验高脂组与老年对照组相比骨骼肌NRF1 的mRNA和蛋白表达进一步下降，同时伴有胰岛素敏感性的下降，这与Patti 等〔3〕研究结果相一致。研究发现噻唑烷二酮类药物可以增加人脐静脉内皮细胞NRF1 mRNA的表达和线粒体密度〔4〕，本研究采用罗格列酮对高脂喂养的老年大鼠进行干预，在IR改善同时伴有 NRF1 mRNA和蛋白表达升高。但是也有研究显示IR患者骨骼肌NRF1表达无明显变化〔5〕，这可能与所选择人群有关。

　　IR或T2DM患者骨骼肌NRF1表达变化的机制尚不清楚。研究发现过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α（PGC1α）作为核转录共激活因子，可调节线粒体生物发生、脂肪酸氧化等诸多生物过程。PGC1α上有NRF1的结合位点，研究发现IR患者骨骼肌PGC1α表达下降，推测PGC1α可能调整NRF1的转录，影响核编码线粒体蛋白和mtDNA的转录和复制，从而介导线粒体的生物发生，最终影响线粒体的能量代谢，导致线粒体功能紊乱和IR〔3〕，具体机制待进一步证实。

参考文献

　1 Petersen KF，Dufour S，Befroy D，et al.Impaired mitochondrial activity in the insulinresistant offspring of patients with type 2 diabetes〔J〕.N Engl J Med，2004；350(7):66471.
　　
　　2 高 宇，宋光耀，王 敬，等.高脂喂养及罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌FAT/CD36表达的影响〔J〕.中华老年医学杂志，2007；26(12)：9314.

　　3 Patti ME，Butte AJ，Crunkhorn S，et al.Coordinated reduction of genes of oxidative metabolism in humans with insulin resistance and diabetes：potential role of PGC1 and NRF1〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(14):846671.

　　4 Fujisawa K，Nishikawa T，Kukidome D，et al.TZDs reduce mitochondrial ROS production and enhance mitochondrial biogenesis Biochem〔J〕. Biophys Res Commun，2009；3(79)：438.

　　5 Skov V，Glintborg D，Knudsen S，et al.Reduced expression of nuclearencoded genes involved in mitochondrial oxidative metabolism in skeletal muscle of insulinresistant women with polycystic ovary syndrome〔J〕. Diabetes，2007；56(9):234955.