抗β淀粉样蛋白单抗杂交瘤的建立及免疫学特性的分析

　　　　作者：赵满仓 魏文青 张艳 焦娟 刘晶 付瑶

【摘要】 目的 制备抗β142淀粉样蛋白（Aβ142）单克隆抗体，并对其免疫学特性进行了分析，为进一步探讨阿尔茨海默病（AD）的发病机制打下基础。方法 用合成的Aβ142偶联血蓝蛋白（KLH）制成抗原，免疫BALB/c小鼠制备抗Aβ142单克隆抗体，并对抗体的免疫学特性进行分析。结果 从24个阳性孔中筛选出6株特异性好效价高的细胞株，命名B1～6，其中B2、B3、B4、B6属于IgG2a亚型，而B1、B5属于IgG2b亚型。测得相对亲和力B6＜B1、B4＜B2＜B3、B5。结论 成功制备出特异性好、效价高的抗Aβ142蛋白单抗杂交瘤细胞株，为下一步的深入研究打下基础。

【关键词】 β142淀粉样蛋白；阿尔茨海默病；单克隆抗体；免疫学特性

大量的流行病学、神经病理学及动物模型研究等均证明了β淀粉样（βamyloid，Aβ）蛋白在阿尔茨海默病（AD）的发病及发展中起着关键性作用〔1～3〕。因此，许多治疗AD的方法靶向减少Aβ产生和清除Aβ沉积。Schnek等〔4〕用人工合成的Aβ142多肽免疫PDAPP小鼠，10月龄以上的动物模型出现老年斑的现象基本被控制。Janus等〔5〕在转基因小鼠分别进行了Aβ的免疫接种实验，不但使动物的Aβ过载得以减轻和老年斑的出现明显减少，而且观察到疫苗对动物模型的认知功能障碍具有预防作用。为此，国内外许多学者都致力于研制针对Aβ不同片段的多克隆及单克隆抗体，用于AD的免疫治疗研究。此外，Aβ抗体还可用于AD的诊断和预防的研究。本研究以合成的Aβ142免疫BALB/c小鼠，利用传统的杂交瘤技术，建立了稳定分泌单抗的6个杂交瘤细胞株，并对所得6株单抗的特异性和亲合力进行了分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　Aβ142多肽由北京博奥森生物技术有限公司采用FMOC有机化学固相合成法合成，HPLC纯化，纯度90%以上；用BDB法偶联载体蛋白KLH（血蓝蛋白）。HRP羊抗鼠IgG、BCA蛋白检测试剂盒博奥森产品；DMEM培养基、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤购自北京化学试剂公司。PEG4000 由卫生部北京老年医学研究所惠赠。

　　1.2 动物

　　BALB/c小鼠，8周龄，购自中国医学科学院动物繁育中心；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，由军事医学科学院五所惠赠。

　　1.3 单克隆抗体的制备

　　1.3.1 动物免疫

　　取1 mg合成的Aβ142KLH抗原与福氏完全佐剂充分混合后，于BALB/c小鼠皮下多点注射，2 w后取抗原0.5 mg与不完全福氏完全佐剂充分混合后，皮下多点注射，融合前3 d，取纯抗原100 μg/0.1 ml由脾脏直接注入。

　　1.3.2 细胞融合

　　融合前1 d按照常规方法制备饲养层细胞。取处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与免疫的小鼠脾细胞以1∶8～1∶10比例在50% PEG的作用下进行融合，用GKN洗二遍，收集细胞，加入含20%胎牛血清的DMEM HAT的选择培养基混匀，种在96孔含有滋养细胞的板孔中。

　　1.3.3 杂交瘤阳性细胞株的筛选

　　待克隆生长至孔径的1/3时取上清进行检测。用含Aβ142 20 mg/ml的碳酸缓冲液（pH9.5）包被96孔酶标板，4℃过夜，PBS洗3次，加培养上清，37℃孵育2 h，洗3次，加HRP羊抗鼠IgG，37℃孵育 2 h，加底物显色。选取阳性孔采用有限稀释法克隆化，待克隆阳性率达100%时扩大培养，制备腹水。

　　1.3.4 效价测定

　　取腹水用生理盐水稀释成不同浓度，用ELISA法测定其效价。

　　1.3.5 抗体纯化

　　取腹水加等量的饱和硫酸铵进行纯化，用0.1 mol/L、pH7.4的PBS进行透析。

　　1.3.6 抗体蛋白含量的检测

　　BCA方法，按照说明书进行。

　　1.4 抗体免疫学特性分析

　　1.4.1 特异性测定

　　取Aβ142抗原、牛血清白蛋白、血蓝蛋白包被酶标板，按上述1.3.3中的方法进行测定，观察其交叉反应。另外用Western印迹检测抗体的特异性。将纯Aβ142蛋白溶解后，进行Tristricine PAGE，转膜，用5%脱脂奶粉溶于TBST封闭，将小鼠Aβ抗体腹水用TBST按1∶1 000稀释，作为一抗孵育，二抗用HRP山羊抗小鼠IgG，也用TBST 1∶1 000稀释，显色后观察。

　　1.4.2 Ig及亚类鉴定

　　用双向免疫扩散法。

　　1.4.3 亲合力测定

　　包被Aβ142抗原，4℃过夜，次日加入系列稀释的纯化抗体（McAb），37℃孵育2 h，洗涤后加入HRP羊抗鼠IgG，37℃孵育2 h，加底物显色。以McAB浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制饱和曲线。当McAb达到一定浓度时，反应曲线出现平峰，该McAb浓度即系100%结合浓度，而50%最大结合浓度的吸光度为100%结合浓度吸光度的一半。因此根据吸光度可从曲线上查出各株McAb的50%的结合浓度，用该浓度分析其相对亲和力。

　　2 结 果

　　2.1 制备6株MCAb

　　此次融合共接种6块96孔细胞培养板，其中有克隆生长的552孔，融合率95.8%；阳性23孔，阳性率4.2%。经过初步测定，选择特异性好、阳性较强的6株扩大培养，收集细胞，制备腹水。将6株McAb分别命名为B1、B2、B3、B4、B5、B6。

　　2.2 效价测定

　　取Aβ142抗原包被酶标板，分别将6株抗体稀释成不同浓度，测得效价分别为B1、B4:1.2×10-7，B2、B6:3.2×10-6，B3、B5：8.1×10-5。

　　2.3 亚类鉴定

　　用双向免疫扩散法测定6株McAb的Ig亚类，其中4株为IgG2a，（B2、B3、B4、B6），2株为IgG2b（B1、B5）。
M：分子量标准；1～6：抗体株B1～B6

　　2.4 特异性测定

　　分别用Aβ142抗原、血清白蛋白、血蓝蛋白包被酶标板，用间接ELISA法检测。结果表明抗体除与Aβ142抗原反应外，与牛血清白蛋白、血蓝蛋白均无交叉反应。经Western印迹电泳测定证实，在相应的位置（分子量约4 000～4 500）处可见测定区带（图1）。两法均证实，此6株McAb特异性较好，都是针对Aβ142多肽抗原的。

　　2.5 亲和力测定

　　各McAb 50%最大结合浓度分别为：B6约0.97 μg/ml，B1、B4约0.83 μg/ml，B2约6.9 μg/ml，B3、B5约0.54 μg/ml。由于亲和力越大，所需抗体浓度越低，因此，相对亲和力B6＜B1、B4＜B2＜B3、B5。

　　2.6 单抗蛋白含量的检测

　　将6株抗体纯化后混合测蛋白含量为8.3 mg/ml。

　　3 讨论

　　从人体的大脑中直接提取Aβ142存在诸多困难，目前多采用人工合成的方法制备。由于合成的多肽抗原分子量较小，结构较为简单，难以产生抗体，需与大分子蛋白质载体偶联，借助载体蛋白的T细胞表位间接诱导B细胞激活，才能产生针对半抗原小分子的抗体。本研究利用合成的Aβ142多肽，采用BDB法偶联KLH（血蓝蛋白）载体，以此抗原免疫BLAB/c小鼠，制备了抗Aβ142的McAb。

　　在制备免疫原的过程中，用传统的方法无法将抗原与福氏佐剂混合，原因在于：①研磨法。该方法抗原用量较大，而合成抗原的量较少，怕研磨法损失抗原过多，无法达到免疫效果；②双注射器对拉法。此合成抗原与完全抗原不同，当抗原与福氏完全佐剂充分混合后即成凝胶状，无法拉动混合。为此本研究采用注射器抽吸法，将抗原与福氏佐剂混合后，用注射器抽进时最好选用8号针头、打出时用4号或6号针头，反复数次，直至达到要求为止。几种方法的比较，此法抗原用量少，不容易浪费，而且效果比较好。在细胞融合后的筛选过程中，为了减少工作量，避免过多的亚克隆，测定上清时同时测定与牛血清白蛋白、血蓝蛋白的交叉反应，凡与上述蛋白有交叉的克隆株直接弃掉，只选取特异性好的进行亚克隆，用此方法筛选大大减少了工作量。另外特异性好与否是单抗制备成功的关键，为此用ELISA测定其特异性的基础上，又用Western印迹电泳测定，以提高特异性检测的准确性。
　　
　　D的重要病理特点是脑内神经细胞分泌的由氨基酸组成的Aβ多肽聚集沉淀而形成的淀粉样斑。国外许多实验表明，在给小鼠腹腔注射Aβ单抗或多抗能有效抑制淀粉样斑的形成〔4，6〕。另有报道，从正常人的血清蛋白中分离出的Aβ抗体给予病人注射，可以有效地减少病人大脑组织的Aβ负载。到目前为止，AD病的早期诊断仍有尚未解决的问题，临床常用的行为学测试不能分辨老年性痴呆和血管性痴呆，而从核医学的活体显像中还不能提供Aβ的代谢影像图。所以，AβMcAb的研究为明确上述诊断提供了可能。在国内外的相关领域，对高特异性的Aβ142肽单抗存在巨大的需求市场。本研究的结果可为AD的诊断、发病机制的研究及治疗方法的探索提供重要的依据。

参考文献

　1 Roberson ED，Mucke L.100 years and counting：prospects for defeating Alzheimer′s diease〔J〕.Science，2006；314(5800):7814.

　　2 聂靖炜，李颖，王瑞涛.β淀粉样蛋白致PC12细胞损伤的研究〔J〕.哈尔滨医科大学学报，2007；41(3):2346.

　　3 罗玲.阿尔茨海默病的治疗研究进展〔J〕.国外医学·老年医学分册，2003； 24(6):24851.

　　4 Schnek D，Barbour R，Dunn W，et al.Immunization with amyloid beta attenuates Alzheimer diseaselike pathology in the PDAPP mouse〔J〕. Nature，1999；400（6740）:1167.

　　5 Janus C，Pearson J，Mc Laurin J，et al.A beta peptide immunization reduces behavioral impairment and plaques in a model of Alzheimer′s disease〔J〕.Nature，2000；408（6815）:97982.

　　6 Morgan D，Diamond DM，Gottschall PE，et al.Amyloid beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer′s disease〔J〕.Nature，2000；408（6815）:9825.