补肾中药对核受体共调节因子表达的影响

　　　　 作者：张磊 郑腾 杨民和 张志灯 蔡晶

【摘要】 目的 通过检测含药血清培养的人乳腺癌细胞中核受体共激活因子(steroid receptor coactivator1，SRC1)和核受体共抑制因子(nuclear receptor corepressor，NCOR)的mRNA表达，从分子水平上探讨补肾中药对核受体共调节因子表达的影响。方法 Wistar大鼠随机分为3个大组，每大组再分雌雄2组，每大组分别用淫羊藿、女贞子、蒸馏水灌胃14 d，制备含药血清，并用含药血清培养雌激素受体缺失的乳腺癌细胞MDAMB231，利用实时荧光定量RTPCR方法检测SRC1和NCOR的mRNA表达。结果 补肾阳中药淫羊藿雄性大鼠含药血清上调了SRC1的表达，对NCOR没有显著影响;而补肾阴中药女贞子下调了SRC1共激活因子的表达，上调了NCOR的表达。结论 补肾中药淫羊藿、女贞子对核受体共调节因子的表达有调节作用。

【关键词】 核受体共激活因子;核受体共抑制因子;淫羊藿;女贞子

　　【Abstract】 Objective To explore the effect of different tonifying kidney on expressions of steroid receptor coactivator1 (SRC1) and nuclear receptor repressor (NCOR) mRNA. Methods Wistar rats were pided into 3 groups and each group was pided into male and female subgroups. Wistar rats were intragastric administration with epimedium， fructus ligustri lucidi and distilled water for 14 days to make drug serum. Human breast carcinoma cell (MDAMB231) was cultured with drug serum and the expressions of SRC1 and NCOR mRNA were detected. Results Tonifying kidney yang Chinese medicine epimedium could upregulate the expression of SRC1 in male rats and had no effect on the expression of NCOR. Tonifying kidney yin Chinese medicine fructus ligustri lucidi could downregulate the expression of SRC1 and upregulate the expression of NCOR. Conclusions Tonifying kidney Chinese medicine epimedium and fructus ligustri lucidi has regulation effect on the expression of steroid receptor coregulator.

　　【Key words】 Steroid receptor coactivator; Nuclear receptor repressor; Epimedium; Fructus ligustri lucidi

　 核受体共调节因子是调节基因表达的一类蛋白，包括共激活因子和共抑制因子，它们通过在不同的条件下与核受体结合从而促进或者抑制核受体对基因转录的激活作用〔1〕。淫羊藿和女贞子都属于补肾类中药。淫羊藿增强性腺功能、调节机体免疫功能、促进骨生长、 延缓衰老，是一类补肾阳、强筋骨的中药〔2〕。女贞子可以治疗阴虚内热、头晕、目花、耳鸣、腰膝酸软、须发早白等，有补肝肾、强腰膝、清热、明目的功能〔3〕。共调节因子与核受体相互作用，对人的生殖生理、生长发育以及新陈代谢都有重要的调节作用〔1〕。淫羊藿、女贞子有类似于激素的效应〔4〕。激素发挥作用除了需要激素受体介导外，还需要共调节因子的协助，那么，淫羊藿、女贞子是否能通过影响共调节因子的表达而发挥作用呢?本实验中，我们通过检测淫羊藿和女贞子含药血清培养的雌激素受体缺失的人乳腺癌细胞MDAMB231中核受体共激活因子(SRC1)和核受体共抑制因子(NCOR)的mRNA相对表达水平，进一步探讨淫羊藿和女贞子药效作用的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 24只3月龄SPF级Wistar大鼠(合格证号：0030624)，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，雄性体重(250±10) g，雌性体重(200±10) g。

　　1.2 试验药品 女贞子、淫羊藿购自福建医药集团;L15，Gibco公司;胎牛血清，PAA公司;Trizol，Invitrogen公司;ReadyToGo RTPCR珠，Amersham公司;PCR反应液，Tiangen公司;荧光定量PCR反应试剂盒，Tiangen公司;引物，如表1，上海鼎安公司;氯仿异丙醇等为实验室常用分析纯药品配制。表1 3对引物参数

　　1.3 主要仪器 电泳仪Biometra公司，型号High vohag power pack p30;核酸蛋白分析仪Amemham biosciences公司型号Ultrospec 2100 pro;台式高速冷冻离心机Hettieh公司，型号Mikro 22 R;凝胶成像系统Kodak公司，型号GL 200;梯度PCR仪Biometry公司，型号96 T;显微镜Olympus公司，型号CX40RF200;实时荧光定量PCR仪MJ Research公司，型号DNA Engine option2。

　　1.4 方法

　　1.4.1 大鼠给药 大鼠分为3个大组，每个大组又分为雌雄两个小组，每小组4只，分好组的大鼠在南京军区福州总医院由专业人员饲养，并且每天灌胃1次，连续灌胃14 d。3个大组依次给予淫羊藿、女贞子两种药液和蒸馏水灌胃。

　　1.4.2 含药血清制备 采用腹主动脉采血法采取灌胃14 d的大鼠血液。待血液凝固后，3 000 r/min离心5 min，取上层淡黄色液体，即为含药血清。0.22 μm的滤膜过滤除菌，-70℃冰箱冻存备用。

　　1.4.3 SRC1、NCOR基因表达量的检测 选用雌激素受体阴性且分裂快的人乳腺癌细胞MDAMB231作为实验细胞。Gibco公司的L15培养基加10%胎牛血清在37℃无CO2条件下培养。细胞48 h传代1次。将传代后的细胞培养24 h后，用5%胎牛血清+10%含药血清的L15培养基培养48 h，提取细胞总RNA，按照总RNA提取试剂盒说明书操作。采用两步RTPCR法进行测定SRC1、NCOR基因表达量。以GAPDH为参照，计算出目的基因与参照基因的差值作为相对定量的依据。差值越大表示目的基因的表达量越小，反之越大，并以此来比较含药血清培养的细胞目的基因表达量的变化，差值越大表示目的基因的表达量越小，反之越大。

　　2 结 果

　　2.1 SRC1、NCOR和GAPDH基因的定性结果 以含药血清培养的雌激素受体缺失的人乳腺癌细胞MDAMB231总mRNA为模板，使用特异引物分别扩增SRC1、NCOR和GAPDH 3个基因片段，琼脂糖凝胶电泳分析结果与预期设计的扩增产物片段大小基本相符(图1)，表明扩增片段是本实验所需要的目的片段。

　　2.2 SRC1和NCOR基因表达量的相对定量结果 淫羊藿组雄性大鼠血清培养细胞的SRC1 mRNA表达量显著高于其他各组(均P<0.01)。含药血清对雌性大鼠血清培养细胞SRC1 mRNA表达量没有显著影响。在雄性大鼠中，只有女贞子组大鼠血清培养细胞NCOR mRNA的表达量高于其他组(均P<0.01)。在雌性大鼠血清中，淫羊藿组、女贞子组NCOR mRNA都显著高于对照组(均P<0.01)(表2)。表2 女贞子、淫羊藿大鼠含药血清培养的细胞中SRC1和NCOR mRNA的相对定量结果1)女贞子组比较，2)与蒸馏水组比较，3)与雌鼠比较：均P<0.01

　　3 讨 论

　　核受体共调节因子通过与相应受体相互作用而发挥激活或抑制受体功能的作用。同一个共调节因子可以和不同的受体相互作用〔5〕，这种作用受到激素水平的调控。本实验中，10%淫羊藿含药血清提高了SRC1的表达，高表达的SRC1促进了受体对靶基因的激活作用，进而促进机体的生殖生理、发育和代谢作用，这可能是淫羊藿补肾阳、强筋骨药理作用的一个机制。共抑制因子与核受体相互作用，利用其拥有的去组蛋白乙酰基转移酶的特性抑制核受体的激活作用〔5〕，抑制靶基因的表达，其可以促进脂肪的合成，对能量代谢有负调控作用〔6〕。本实验中，10%女贞子含药血清降低了SRC1的表达，而提高了NCOR的表达，因而女贞子促进了能量的储存，这可能是女贞子补肾阴作用的一个机制。本实验的结果揭示SRC1和NCOR可能通过和雌激素受体以外的受体结合共同调节机体的代谢。

　　本实验发现雌性细胞株中SRC1表达较雄性细胞株中表达量高，这与研究〔7〕一致。本实验表明淫羊藿对雄性大鼠有更明显的作用，这是因为淫羊藿含有雄激素样作用，可以刺激核受体共调节因子的表达。综上，女贞子和淫羊藿对核受体共调节因子表达均有重要的影响。

参考文献

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