谷胱甘肽与顺铂合用对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响

　　　　 作者：徐艳岩 安郁宽 李波清 李京敏

【摘要】 目的 探讨谷胱甘肽 (GSH) 与顺铂 (CDDP) 联合应用对人肝癌细胞HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法 应用酸性磷酸酶法 (APA) 检测细胞生长抑制率;用倒置显微镜观察经CDDP、GSH处理后的细胞形态学改变;采用流式细胞术研究GSH与CDDP合用对细胞周期的影响;AnnexinVFITC/PI双染检测细胞凋亡率;罗丹明123染色检测线粒体膜电位 (Δψm) 变化。结果 GSH与CDDP联合应用可以明显抑制HepG2细胞增殖，癌细胞出现凋亡形态变化，其作用明显高于GSH组与对照组细胞，且不低于CDDP单独给药组;GSH与CDDP联合应用引起Δψm更明显地下降。结论 GSH与CDDP联合用药不降低CDDP对肝癌细胞的作用，其诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用可能是通过线粒体通路实现的。

【关键词】 谷胱甘肽;顺铂;肝癌细胞;凋亡;细胞周期

　　【Abstract】 Objective To explore the effect of glutathione (GSH) combined with cisplatin (CDDP) on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells. Methods Acid phosphatase assay (APA) was used to determine the inhibition rate of cells. Inverted microscope was used to observe the morphological changes of cells after CDDP and GSH treatment. Flow cytometry was used to study the effect of GSH combined with CDDP on the cell cycle. AnnexinVFITC/PI was carried out to evaluate the apoptosis. The change of mitochondrial membrane potential (Δψm) was observed by means of Rhodamine123. Results GSH combined with CDDP could obviously inhibit the proliferation and apoptosis of HepG2 and the apoptosis rate in GSH combined with CDDP group were significantly higher than those of GSH group and the control group， moreover， were not lower than those of CDDP alone group. GSH combined with CDDP could lead to more obvious decline of Δψm than CDDP. Conclusions GSH combined with CDDP could not reduce the inhibition effect of CDDP on HepG2. The mitochondia pathway plays an important role in inducing apoptosis of HepG2.

　　【Key words】 Glutathione; Cisplatin; Hepatoma; Apoptosis; Cell cycle

　　顺铂(CDDP) 是目前临床上应用较广泛的一种高效抗癌药物，但因其有肝、肾、神经等毒性而使其应用受到限制。有关文献表明CDDP对肝、肾、神经的损伤机制是氧化损伤，与自由基损伤有关〔1，2〕。大量研究表明，谷胱甘肽 (GSH) 作为一种较强的抗氧化剂，抑制了氧化损伤，对CDDP肾毒性具有明显的保护作用〔3～5〕，也可预防CDDP所致的肝、肾、神经等损伤〔6～8〕。但是GSH对细胞的保护作用是否影响CDDP对人肝癌细胞的损伤作用，即是否影响CDDP的抗癌效果，尚需进一步的研究探讨。本研究采用联合应用GSH和CDDP及单独应用CDDP作用于体外培养的人肝癌细胞HepG2，探讨GSH对CDDP引起的肝癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡的影响，为其应用于肿瘤的治疗，减少CDDP的毒副作用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器 CDDP购自齐鲁制药有限公司，批号512047CF;注射用还原型GSH为绿叶制药产品，批号200709143;DMEM培养基购于Gibco BRL公司;新生牛血清购于PAA Laboratories GmbH公司;硝基苯磷酸盐购自Sigma公司;罗丹明123为SigmaAldrich公司产品;Annexin V凋亡检测试剂盒购于北京宝赛生物技术有限公司;酶标仪 (BioRad M680);流式细胞仪 (Becton DickinsonLSR，USA)。

　　1.2 细胞培养 人肝癌细胞HepG2培养于含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中。

　　1.3 酸性磷酸酶法(APA)检测肝癌HepG2生长抑制率 取对数生长期的HepG2细胞按2×104/ml的密度接种于96孔板中，每孔100 μl，于37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后各组加入药物。CDDP (3 μg/ml) 和GSH (10、20、40、80 μg/ml) 分别组成单药组和GSH+CDDP联合用药组，无药物处理组设为对照组，以不加细胞只加培养液的孔作为空白对照。每个浓度设5个平行孔，常规培养24、48、72 h后，每孔用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液 (pH7.0) 200 μl洗涤2次，加入10 mmol/L的硝基苯磷酸盐溶液100 μl(0.1 mol/L醋酸缓冲液配制，含1 g/L TritonX100)，置于37℃孵育2 h后，每孔加入1 mol/L碳酸氢钠10 μl中止反应。用酶联免疫检测仪在405 nm处检测光吸收度 (A值)记录结果，抑制率 (%) = (1-实验组平均A值/对照组平均A值) ×100%，重复实验3次。

　　1.4 细胞形态学观察 各组处理24 h后，倒置显微镜下观察各组细胞形态的变化。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期分布 取对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后加入药物。实验分组为GSH 20 μg/ml、CDDP 3 μg/ml和联合用药组GSH 20 μg/ml+CDDP 3 μg/ml，另设不加药的对照组。常规培养24、48 h后，细胞经胰蛋白酶溶液消化，收集单细胞悬液，磷酸盐缓冲液洗涤，加入70%冷乙醇4℃固定过夜。PBS洗2次，RNA酶消化37℃水浴30 min，加入终浓度为20 mg/L的碘化丙啶染液。各组细胞应用流式细胞仪进行细胞周期分布测定。不同分期细胞所占比例由ModFit细胞周期分析软件进行分析。

　　1.6 AnnexinVFITC/PI双染检测肿瘤细胞凋亡 取对数生长期的HepG2细胞接种6孔板，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后加入药物。实验分组为GSH 20 μg/ml、CDDP 3 μg/ml和联合用药组GSH 20 μg/ml+CDDP 3 μg/ml，另设不加药的对照组。常规培养24、48 h后，收集各组细胞。按试剂盒方法进行AnnexinVPI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

　　1.7 流式细胞仪检测线粒体膜电位(Δψm) 取对数生长期的HepG2细胞接种与6孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后加入药物。实验分组为GSH 20 μg/ml、CDDP 3 μg/ml和联合用药组GSH 20 μg/ml+CDDP 3 μg/ml，另设不加药的对照组。常规培养24、48 h后，收集各组细胞，PBS洗涤2次。上述各组加入荧光指示剂罗丹明123染色用以标记活细胞，终浓度为5 mg/L，于37℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，磷酸盐缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化 (激发波长488 nm，发射波长525 nm)。

　　1.8 统计学处理 实验结果均以x±s表示，用SPSS13.0统计软件进行组间t检验。

　　2 结 果

　　2.1 GSH与CDDP单独及联合应用对HepG2细胞生长的抑制作用 APA结果显示，GSH (10、20、40、80 μg/ml)+CDDP(3 μg/ml)作用HepG2细胞24 h后细胞生长抑制率分别为52.02%，63.60%，66.16%和63.87%;48 h后抑制率分别为69.64%，70.29%，75.05%和69.32%;72 h抑制率分别为97.11%，97.81%，97.89%和95.67%。CDDP组24、48、72 h细胞生长抑制率分别为67.53%，73.86%，96.51%。CDDP组与联合用药组抑制癌细胞的细胞生长抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。随作用时间的延长，其抑制作用逐渐增强，其中20、40 μg/ml GSH联合用药组对肝癌细胞的生长抑制率增加更为明显，见表1。

　　2.2 形态学观察 倒置显微镜下观察可见，GSH组和对照组细胞轮廓清晰，呈多边形，贴壁生长。培养24 h后，GSH+CDDP组和CDDP组HepG2细胞形态明显改变，细胞数减少，损伤、死亡的细胞增多，细胞皱缩、变圆、变小，胞质中出现大量膜泡。贴壁能力下降，多数呈现脱落、漂浮的生长状态，见图1。

　　2.3 GSH与CDDP单独及联合应用对细胞周期的影响 从细胞周期各时相分布来看，联合用药组与CDDP组相比，24、48 h S期细胞分布比例无明显差异。联合用药组、CDDP组与癌细胞作用48 h后，与对照组细胞比较，阻滞在S期的细胞百分率增多。CDDP主要作用靶点为DNA，可抑制癌细胞的S期DNA复制过程，属细胞周期非特异性药物。通过分析，认为GSH与CDDP联用时，对癌细胞周期分布没有明显的改变，主要影响细胞周期S期向G2/M期的转变过程，将癌细胞阻滞在S期，减少进入G2/M期的细胞数量，阻滞细胞分裂的进程，诱导细胞发生凋亡，见表2。表1 谷胱甘肽与顺铂联用对人肝癌HepG2细胞增殖能力的影响与对照组比较:1)P<0.01，下表同表2 GSH与CDDP联用对HepG2细胞周期的影响对HepG2细胞形态的影响(×100)

　　2.4 GSH与CDDP单独及联合使用对HepG2细胞凋亡率的影响 对照组细胞培养24、48 h后细胞凋亡率分别为 (5.56±1.41)%，(9.96±2.16)%;CDDP组与GSH+CDDP组处理细胞24 h后细胞凋亡率分别为 (11.01±3.66)%，(9.37±6.52)%;作用48 h后细胞凋亡率分别为 (55.89±4.35)%，(55.98±4.26)%，两加药组与对照组相比较差异均有统计学意义(P<0.01); GSH+CDDP组与CDDP组比较差异无统计意义(P>0.05)。

　　2.5 GSH与CDDP单独及联合使用对HepG2细胞线粒体膜电位的影响 GSH与CDDP联合作用于HepG2细胞24、48 h后，联合用药组弱荧光部分细胞百分比增高，线粒体与罗丹明123结合能力下降，与对照组和CDDP组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。表3 各组HepG2细胞线粒体跨膜电位检测

　　3 讨 论

　　CDDP是目前临床上常用的广谱抗癌药物，可与癌细胞DNA链上的碱基结合，干扰DNA复制和RNA转录，从而抑制癌细胞分裂，但因其毒副作用大而使其使用受到限制。普通的临床剂量就可造成肾损害，高剂量时也可造成肝毒性〔9〕。

　　GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，是人体细胞内的重要代谢物质，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，能够清除体内的超氧离子及其他自由基，保护细胞膜的完整性，维持细胞的正常代谢。研究发现，作为抗肿瘤治疗的辅助用药，GSH对化疗药物所导致肝损害有较好的预防作用及治疗效果〔10〕。

　　本实验认为GSH并未明显影响CDDP的细胞毒性。已有资料表明，CDDP造成脏器损伤的主要原因为自由基损伤，GSH最重要的作用就是抗氧化作用。GSH在抗自由基保护脏器的同时，并未影响到铂的代谢和蓄积〔11，12〕。

　　Annexin是一种分子量为35～36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(PS) 高亲和力特异性结合。以标记了FITC的Annexin作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。PI是一种可以与DNA和RNA特异性接合的核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染，将二者匹配使用，可以将活细胞、凋亡早期细胞、凋亡中晚期细胞和坏死细胞区分开来。由流式细胞仪检测结果得知，随着作用时间的延长，GSH明显降低了细胞的凋亡率，但给予CDDP+GSH后，GSH并未影响CDDP引起的细胞凋亡。

　　细胞凋亡的主要途径之一是线粒体介导的凋亡通路。凋亡的重要事件与线粒体跨膜电位的改变有关。线粒体膜两侧质子及其他离子的不对称分布形成了线粒体Δψm，罗丹明123可被线粒体质子泵摄入，其摄入量反应线粒体跨膜电位高低。线粒体Δψm的降低是细胞发生凋亡的标志事件〔13〕。本实验说明GSH的给予并未影响到CDDP导致的线粒体通透性改变，提示了联合用药组线粒体功能受到损伤。

　　综上所述，根据CDDP的作用机制和GSH的抗氧化保护作用，我们可以认为GSH只是对抗了自由基的部分氧化作用，而GSH作为一种保护剂，并未改变CDDP的细胞毒靶位，也未改变CDDP的细胞毒性。因此我们推测GSH降低CDDP毒性的同时并未影响CDDP对肝癌细胞增殖抑制作用和诱导凋亡的影响。探讨CDDP的损伤机制及GSH等抗氧化剂对化疗药物的作用，可以更有针对性地选择治疗方案，减少损伤，为临床应用提供理论依据。

参考文献

　　1 廖英俊，汤 浩，金亚平.抗癌药顺铂对小鼠的耳、肾和肝毒性及其机制的研究〔J〕.中国药理学通报，2004;20(1)：825.

　　2 卢永科，川岛明，堀井郁夫，等.顺铂对大鼠肝细胞毒性及谷胱甘肽的保护作用〔J〕.中国公共卫生，2004;20(4)：4401.

　　3 卢永科，川岛明，堀井郁夫，等.谷胱甘肽对顺铂致猴和大鼠肾细胞毒性的影响〔J〕.卫生毒理学杂志，2003;17(1)：245.

　　4 卢永科，李秋娟，陈新志，等.谷胱甘肽对顺铂所致肾小管上皮细胞毒性的保护作用〔J〕.大连医科大学学报，2002;24(4)：2446.

　　5 翁淑兰，王桂芳，刘士云，等.谷胱甘肽对顺铂所致肾损伤的保护作用〔J〕.职业与健康，2009;25(4)：3413.

　　6 陆艳姣.还原型谷胱甘肽防治紫杉醇顺铂化疗肺癌后肝损害效果观察〔J〕.临床肺科杂志，2009;14(5)：678.

　　7 宋子正，商琰红，臧爱民，等.谷胱甘肽对紫杉醇联合顺铂化疗所致神经毒性的预防作用观察〔J〕.山东医药，2009;49(18)：989.

　　8 赵 红.还原型谷胱甘肽预防顺铂化疗致肝肾功能损害104例观察〔J〕.陕西医学杂志，2007;36(9)：12136.

　　9 Zicca A，Cafaggi S，Mariggio MA，et al.Reduction of cisplatin hepatotoxicity by procainamide hydrochloride in rats〔J〕.Eur J Pharmacol，2002;442(3)：26572.

　　10 郭随章.谷胱甘肽的临床应用概况〔J〕.药学实践杂志，2001;19(4)：2045.

　　11 韩咏梅.减轻顺铂毒性的研究进展〔J〕.国外医学·肿瘤学分册，1999;26(2):868.

　　12 王桂芳，钟亚莉，李清钊，等.谷胱甘肽对顺铂在大鼠体内组织中蓄积量影响的研究〔J〕.中国预防医学杂志，2008;9(2)：1535.

　　13 Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis〔J〕.Nature，2000;407(6805)：7707.