钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ调控SSH1L活性的作用

　　　　　　 作者：王杨 王岩 赵建武 高忠礼

【摘要】 目的 探讨钙(Ca2+)/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)对Slingshot1L(SSH1L)活性的调控作用。方法 用脂质体法将含MycSSH1L的重组质粒转染至MG63细胞，经不同浓度的钙离子载体A23187诱导10 min，蛋白印迹实验，观察Pcofilin、PSSH1L、PCaMK Ⅱ水平的变化;体内及体外实验检测CaMKⅡ对SSH1L的磷酸化及活性调控作用。结果 当 A23187浓度为1 μmol/L时CaMK Ⅱ活性达到了最大，同时此浓度下Pcofilin水平以及SSH1L的978位点丝氨酸的磷酸化水平升高。体外实验证实CaMK Ⅱ可使SSH1L(WT)磷酸化，但是对其突变体SSH1L(2 SA)无作用;同时CaMK Ⅱ明显抑制了SSH1L(WT)的活性，但对SSH1L(2 SA)的活性无作用。结论 CaMKⅡ对SSH1L的活性具有明显调控作用，且与SSH1L的丝氨酸位点密切相关。

【关键词】 钙(Ca2+)/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ);Slingshot1L(SSH1L);骨肉瘤

　　【Abstract】 Objective To investigate the regulation of CaMKⅡ on Slingshot1L(SSH1L)activity. Methods The recombinant plasmids containing MycSSH1L was transfected to cell MG63 through liposome method and incubate for ten min via calcium ionophore A23187 of different concentrations; then the changes of Pcofilin， PSSH1L and PCaMK Ⅱ were observed by Western blot， and the phosphorylation and activity regulation of CaMKⅡon SSH1L were tested by in vivo and in vitro assays.Results When the concentration of A23187 was 1 μmol/L， the activity of CaMK Ⅱ was the highest and the levels of Pcofilin and phosphorylation on Ser 978 of SSH1L were increased too. In vitro assays had proved that CaMK Ⅱ could phosphorylate SSH1L(WT and NP)， SSH1L(C)， but had no effect on its mutant SSH1L (2SA)); otherwise， CaMK Ⅱ inhibited the activity of SSH1L (WT) obviously， but had no effect on SSH1L(2SA). Conclusions CaMKⅡ can regulate the activity of SSH1L.

　　【Key words】 CaMKⅡ; Slingshot1L(SSH1L); Osteosarcoma

　 在钙感受蛋白中，钙/钙调素依赖蛋白激酶家族(Ca2+/CaMK)中CaMKⅡ的作用受到越来越多的关注。Ca2+/CaMK是丝/苏氨酸蛋白酶，受钙调素(CaM)调节。Ca2+/CaM 结合到 CaMKⅡ亚单位上，首先触发其作用底物的磷酸化反应，同时促进CaMKⅡ分子内第 286 位苏氨酸的自磷酸化，从而导致Ca2+/CaM的解离速率下降并阻止该酶在CaM解离后的失活〔1～3〕。本课题组的前期工作已经证明Ca2+/PP2B通路通过激活下游效应子Slingshot 1L(SSH1L)、进一步激活其下游的Cofilin〔4〕。本文旨在探讨CaMK Ⅱ对SSH1L活性的调控作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人成骨肉瘤MG63细胞为本实验室保存。重组质粒MycSSH1L(WT)、MycSSH1L(S937A S978A/2SA)以及recombinant cofilinHis6由王岩教授惠赠。脂质体 2000( Invitrogen公司)。高糖DMEM培养基(美国Gibco 公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶和EDTA(Sigma 公司)。A23187，KN93，CaM，重组Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain，Calbiochem)。抗体：Myc (9E10;Roche)，HA (3F10;Roche)，Pcofilin，Cofilin(Santa Cruz)， CaMKⅡδ1δ4 (Trans Genic Inc.)，PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒(迈晨科技有限公司)。

　　1.2 蛋白印迹实验 MG63细胞铺于35 mmol/L培养皿中，待细胞密度达到60%～70%时，转染MycSSH1L，48 h后换无血清培养基培养3 h，分别加入浓度为0.5，1，2.5，5 μmol/L的A23187孵育10 min后裂解细胞，离心取上清加入凝胶加样缓冲液，沸水浴上加热5 min，上样、电泳、转膜、杂交〔一抗分别为Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及CaMK Ⅱ δ(14)〕、ECL显色。

　　1.3 体外激酶测定 MycSSH1L(WT)及其突变体MycSSH1L(2 SA)分别转染至MG63细胞，48 h后采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒的方法及抗cmyc抗体，对照组为抗IgG抗体。回收MycSSH1L，加入0.6 μg/ml重组活性CaMKⅡ(单独或同时加入抑制剂KN93)以及100 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 于 20 μl 激酶反应缓冲液中，30℃反应40 min。反应产物进行SDSPAGE电泳、转膜，应用放射自显影技术检测32P 标记的SSH1L水平。

　　1.4 体外SSH1L磷酸酶活性测定实验 MycSSH1L(WT)或MycSSH1L (2 SA)转染至MG63细胞，48 h后，采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒的方法及抗cmyc抗体，对照组为抗IgG抗体。回收MycSSH1L，加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(单独或同时加入抑制剂KN93)，20 μg/ml CaM，以及 6.3 μg/ml cofilinHis6 于 20 μl 反应缓冲液(50 mol/L HEPES，pH 7.4，0.1 mol/L CaCl2，0.5 mol/L EDTA，3 mol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，1 mol/L dithiothreitol，0.5 mg/ml BSA，1 μg/ml leupeptin)，中30℃反应2 h。反应产物进行SDSPAGE电泳、转膜、杂交(一抗分别为Pcofilin，Cofilin， cmyc 抗体)、ECL显色。

　　2 结 果

　　2.1 Ca2+浓度对Pcofilin、PSSH1L、PCaMK Ⅱ水平的影响 用不同浓度A23187孵育MG63细胞检测Pcofilin磷酸化水平，结果显示当浓度为1 μmol/L时Pcofilin水平呈上升趋势，然后下降，5 μmol/L时降至最低(图1A，1B)，SSH1L的978位丝氨酸的磷酸化水平也在1 μmol/L时上升(图1B)，同时PCaMK Ⅱ(代表其激酶活性)水平也在1 μmol/L时达到最高(图1C)，说明Pcofilin磷酸化水平上升可能与SSH1L 978丝氨酸位点磷酸化及CaMK Ⅱ激活密切相关。

　　2.2 CaMK Ⅱ对SSH1L的磷酸化作用 通过放射自显影技术检测CaMK Ⅱ对SSH1L野生型及其突变体的磷酸化作用，结果显示CaMK Ⅱ可使SSH1L(WT)磷酸化，上述作用可被CaMK Ⅱ有效抑制剂KN93完全阻断;但是对其突变体SSH1L(2 SA)无作用，说明CaMK Ⅱ对SSH1L的磷酸化作用与其937，978位点丝氨酸密切相关(图2)。

　　2.3 CaMK Ⅱ对SSH1L的活性调控作用 为进一步证明CaMK Ⅱ对SSH1L的活性调控作用，进行了体外SSH1L磷酸酶活性测定实验。结果显示，CaMK Ⅱ明显抑制了SSH1L(WT)的活性(图3A)，但对SSH1L(2 SA)的活性无作用(图3B)。

　　图3 CaMK Ⅱ对SSH1L的活性调控作用

　　3 讨 论

　　哺乳动物中CaMKⅡ由4种不同基因编码，每个CaMKⅡ亚基包含3个结构域：裂解域、调节域、连接域。每个N末端是裂解域，随后是具有自身抑制功能的调节域，再随后是CaM的结合位点。每个C末端是亚基相互聚集的结合域，也可能和其他蛋白发生相互作用。在基础状态下，裂解域的活性被自身调节域抑制，从而防止其与基质连接;与Ca2+/CaM结合后，蛋白构象改变使抑制域的ATP与裂解域的蛋白基质结合位点改变，使CaMKⅡ活化。δ亚基自身调节域中的自身磷酸化位点是Thr287、Thr306/Thr307;与Ca2+/CaM结合后，Thr287自身磷酸化，并产生CaMKⅡ的自主活性;一旦Thr287磷酸化，且与Ca2+/CaM解离，自身磷酸化发生于Thr306/Thr307钙调素结合位点，从而阻止与Ca2+/CaM再次结合，防止酶的进一步活化，当游离Ca2+的浓度是0.5～1 μmol/L时，CaMKⅡ的活性达到最大〔5〕。

　　SSH是一种专用的Cofilin磷酸酶，其功能的异常可以导致Pcofilin水平上升。研究表明SSH家族可以通过对Cofilin的去磷酸化在微丝骨架的调节中扮演重要角色〔6〕。

　　本研究使用不同浓度钙离子载体A23718处理MG63细胞，发现1 μmol/L时CaMK Ⅱ活性达到了最大。同时此浓度下Pcofilin水平以及SSH1L的978位丝氨酸的磷酸化水平升高。体外激酶测定及SSH1L磷酸酶活性测定显示，CaMK Ⅱ可使SSH1L(WT)磷酸化，但是对其突变体SSH1L(2 SA)无作用;同时CaMK Ⅱ明显抑制了SSH1L(WT)的活性，但对SSH1L(2 SA)的活性无作用。这说明，在钙关联的信号通路中，CaMK Ⅱ对SSH1L活性具有明显的调控作用，且与SSH1L的丝氨酸937，978位点密切相关。

参考文献

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