重组人粒细胞集落刺激因子对大鼠脑出血后神经功能损伤的保护

【摘要】 目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)动员骨髓干细胞对大鼠脑出血(ICH)后神经功能损伤的影响。方法 实验动物随机分为假手术组、治疗组、ICH组。利用鼠脑立体定位定向仪、采用尾动脉取自体血法制模型，治疗组于术后1 h始腹部皮下注射GCSF(50 μg·kg-1·d-1)，在相应时间点大鼠行神经功能评分(NSS)后处死，用免疫组化法观察脑出血周围组织caspase3、Brdu蛋白表达。结果 治疗组神经功能评分和caspase蛋白表达均明显低于ICH组，二者相比有显著差异(P<0.05)，治疗组的Brdu阳性细胞均多于ICH组，但只有第1周的差别有显著性(P<0.05)。结论 rhGCSF动员骨髓干细胞对脑出血大鼠有明显的神经保护作用。

【关键词】 脑出血;重组人粒细胞集落刺激因子;骨髓干细胞;大鼠

干细胞移植治疗脑血管病及变性疾病已取得一定成效。但临床上因移植操作存在有创性，同时干细胞来源困难，体外培养、分离纯化技术尚未成熟及存在移植排斥等难题，使干细胞移植治疗脑血管病在短期内难以推广应用。重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)动员的骨髓干细胞(BMSC)既有干细胞的部分优点，又能克服干细胞移植的技术难题，理论上成为治疗脑血管病的理想方法之一。rhGCSF对脑出血(ICH)是否具有神经保护作用目前国内尚无研究，本实验拟用rhGCSF治疗脑出血大鼠，探讨rhGCSF是否对脑出血有神经保护作用及可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 Wistar大鼠72只，鼠龄3～4个月，雌雄不拘，体重250～300 g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。

　　1.2 药物与试剂 重组人粒细胞刺激因子注射液(rhGCSF，商品名金磊赛强)，购自长春金赛药业有限责任公司;溴脱氧尿苷(Brdu)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3抗体(兔抗caspase3)和溴脱氧尿苷单克隆抗体(兔抗Brdu)购自北京博奥森生物技术有限公司;SP试剂盒、加强型DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物分组及处理 实验动物随机分为假手术组、治疗组、ICH组。ICH组和治疗组均用断尾取自体血方法制备ICH模型，假手术组仅经注射点注入生理盐水。ICH后治疗组在术后1 h开始每天腹部皮下注射GCSF(50 μg·g-1·d-1)，另两组腹部皮下注射等量生理盐水。各组分别在术后1、3、7、14 d时间点行神经功能缺损(NSS)评分后处死动物。取脑。各组各时间点各取6只动物。各组大鼠在处死前1 d，腹腔注射Brdu(50 mg/kg)3次，间隔2 h，以标记分裂的骨髓干细胞。

　　1.3.2 免疫组织化学染色 各组大鼠在不同时间点行10%水合氯醛麻醉后(2 ml/kg)，行心脏灌注及固定，脑组织石蜡包埋切片，分别行Brdu、caspase3抗体免疫组化染色，检测免疫阳性细胞，严格按照试剂盒说明书操作。对Brdu、caspase3免疫阳性细胞进行计数，出血灶周边区随机选取5个高倍视野，计算阳性细胞数，取其平均数。

　　1.4 统计学处理 用SPSS 15.0统计软件包进行两样本均数间的t检验，结果用x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 神经功能缺损评分结果 ICH组和治疗组均产生不同程度的神经功能缺损，假手术组无神经功能缺损。术后1 d时ICH组与治疗组评分没有显著差别(P>0.05)，3、7、14 d时治疗组评分明显低于ICH组(P<0.05)。见表1。

　　2.2 免疫组织化学染色结果

　　2.2.1 Brdu免疫组织化学染色结果 ICH后在出血灶周边可见Brdu阳性细胞，但Brdu阳性细胞数随出血时间的延长而逐渐减少。在同一时间点，治疗组的Brdu阳性细胞均多于ICH组，但只有第1周的差别有显著性(P<0.05)。见表2。表1 rhGCSF对ICH后NSS评分的影响(x±s，n=6)表2 rhGCSF对ICH后Brdu阳性细胞数的影响

　　2.2.2 caspase3免疫组织化学染色结果 ICH后，各时间点治疗组及ICH组表达均增高，但ICH组均较治疗组增高明显。见表3。表3 rhGCSF对ICH后caspase3阳性细胞数的影响

　　3 讨 论

　　以往认为成熟神经系统的神经细胞是终极细胞，受损后不能再生，而目前越来越多的证据表明脑有自身修复功能，成年脑的脑室下区、海马齿状回、室管膜区等区域存在自我更新和多种分化潜能的神经干细胞〔1〕。脑出血可诱导内源性干细胞的增殖、分化，但因数量少，因此诱导的自身修复能力有限。神经干细胞移殖虽然为脑损伤的治疗带来生机，但伦理、来源、移殖损伤和排斥反应等因素限制了其临床应用。

　　BMSC动员是新兴的细胞移殖方法，利用细胞因子使主要位于骨髓中的干细胞进入外周血，通过血液循环到达损伤组织以达到细胞移殖的目的。GCSF是BMSC强有力的动员剂，可以提高外周血干细胞数量，且可向脑损伤部位迁移，在脑损伤的特定病理环境中向神经细胞分化，以修复受损脑组织，从而起到神经保护作用。

　　Mezey等〔2〕研究认为，骨髓间充质干细胞能够迁移到受损的脑组织区域并分化成不同的脑组织，包括神经细胞和胶质细胞。Shuy等〔3〕用大鼠模型证实rhGCSF能动员骨髓间充质干细胞归巢至脑缺血损伤区，促进神经修复和功能康复，缺血大鼠用rhGCSF后MRI检查可见病灶明显缩小，并用免疫双标记染色证实rhGCSF能动员骨髓间充质干细胞在脑内分化为神经元和胶质细胞。这些研究为中枢神经系统移植BMSC，促进神经再生，改善中枢神经系统损伤后的生物学行为成为可能。

　　rhGCSF是BMSC强有力的动员剂，它动员的BMSC包括造血干细胞和骨髓间充质干细胞〔4〕。骨髓间充质干细胞能产生碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子及血管内皮生长因子等，使分化的祖细胞向着生成神经细胞的方向分化。造血干细胞具有多向分化潜能，它在病理情况下可以“自发”地向损伤组织趋化，并在组织微环境作用下分化为受损脑组织特性的细胞，但确切机制尚不明确，可能和BMSC能够表达众多趋化因子受体和各种细胞黏附因子，以及促进出血区各种炎症介质的释放、脑细胞黏附因子的表达，调控BMSC的趋化有关。

　　本研究用断尾取自体血方法制备ICH模型，治疗组于术后1 h开始给予rhGCSF治疗，比较不同时间点对照组和治疗组的NSS评分发现，两组的NSS随出血时间延长而逐渐减轻，说明存在神经系统的自身修复，但ICH组NSS较治疗组更严重，说明仅靠神经系统代偿性的自身修复是不够的，会遗留较明显的NSS，而rhGCSF治疗可以减轻NSS。

　　Brdu是一种嘧啶类似物，可于细胞合成期(S期)替代胸腺嘧啶掺入到细胞核内，作为新生细胞的特异性标记〔5〕。近年来的研究发现，脑缺血后神经干细胞可增殖分化，参与缺血性脑损伤的修复过程。

　　研究发现，应用5溴尿嘧啶标记观察细胞增殖情况时，沙土鼠在短暂全脑缺血5 min再灌注后5 d、10 d，海马齿状回区Brdu标记的干细胞数目增加，提示有神经干细胞的增殖加速，缺血性脑损伤后自身神经干细胞具有自发活化作用〔6〕。本实验发现诸多证据支持Brdu染色阳性细胞为新生增殖细胞：如阳性细胞多分布于脑出血灶周围组织中;阳性细胞可呈丛集性，提示为诱导分化生成而非DNA修复等。这些现象均表明Brdu染色阳性细胞为新生增殖细胞。

　　本研究发现脑出血后ICH组和治疗组的出血灶周边区均可见Brdu阳性细胞，尤其是第1周，灶周存在较多的Brdu阳性细胞，提示细胞增殖活跃，rhGCSF治疗可促进脑出血损伤的细胞增殖，有促进干细胞性质的细胞转化为胶质细胞增生、修复脑出血损伤的作用。

　　天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白激酶家族(caspases)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，caspase3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，处于级联反应的核心位置，发挥非常重要的作用，被称为死亡蛋白酶。如果在caspase3激活之前进行干预，可以有效抑制凋亡的发生〔7〕。

　　本实验中，ICH后各时间点治疗组及ICH组caspase3表达均增高，但ICH组均较治疗组增高明显，说明rhGCSF治疗可以减少脑出血后神经元凋亡的发生，促进脑损伤神经元的分化和再生，起到神经保护的作用。

　　GCSF的神经保护作用分析可能与以下机制有关：(1)抗炎症作用：GCSF有显著抗炎症作用，有研究证实在大鼠短暂和持久大脑中动脉闭塞模型中，GCSF治疗组IL1β mRNA较对照组明显减少，且GCSF能显著减轻水肿和减小梗死体积，促进神经功能恢复〔8〕。(2)抗凋亡作用：GCSF与脑内GCSFR结合引起STAT3上调，后者作用于神经元上的抗凋亡蛋白Bcl2〔9〕。(3)促进血管生成和神经发生：在损伤、缺血状态下，循环干细胞选择性迁移至缺血部位，支持受损组织的重塑和功能重建〔10〕。Shuy等〔3〕用大鼠模型证实，GCSF以化学激活这种方式动员足量的BMSC并归巢至脑损伤区，在脑内分化为神经元和胶质细胞，并促进血管再生，促进神经修复和功能康复。这个作用能增加营养因子的产生，如神经胶质细胞源性神经营养因子和脑源性神经营养因子，促进损伤实质细胞的修复，提示损伤脑组织可能特异性地吸引骨髓源性细胞。因此，进一步的探索GCSF的作用机制，对于开发新的脑卒中治疗方案有重要的意义。

　　综上所述，rhGCSF可动员BMSC到外周血，在脑出血时，循环中的干细胞可以透过血脑屏障，进入脑实质并迁移至受损脑组织，释放某种营养因子并分化为神经元和神经胶质细胞，从而增加神经细胞数量，增强其代偿修复的能力。大鼠ICH后，给予rhGCSF治疗可以有效促进神经细胞分化，改善神经功能评分，具有神经保护作用，为探索干细胞治疗脑出血更加简便有效的方法提供了实验依据。

参考文献

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　　2 Mezey E，Key S，Vogelsang G，et al.Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(3)：13649.

　　3 Shuy WC，Lin SZ，Yang HI，et al.Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colonystimulating factorstimulated stem cells〔J〕. Circularion，2004;28：184754.

　　4 Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，et al.Neovascularization of ischemic myocardium by human bonemarrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reduces remodeling and improves cardiac function〔J〕.Nat Med，2001;7(4)：4306.

　　5 Kuhn HG，DickinsonAnson H，Gage FH.Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat：agerelated decrease of neuronal progenitor proliferation〔J〕.J Neurosci，1996;16(6)：202733.

　　6 Jiang YH，Balkrishna N，Jahagirdar，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow〔J〕.Nature，2002;20(1)：37.

　　7 Sharma S，Ravichandran V，Jain PK.Prediction of caspase3 inhibitory activity of 1，3dioxo4methyl2，3dihydro1hpyrrolo〔3，4c〕quinolines:QSAR study〔J〕.Enzyme Inhib Med Chem，2008;23(3):42431.

　　8 Gibson CL，Jones NC，Prior MJ，et al.GCSF suppresses edema formation and reduces interleukin1β expression after cerebral ischemia in mice〔J〕. Neuropathol Exp Neurol，2005;64(7):7639.

　　9 Graham SH，Chen J，Clark RS.Bcl2 family geneproducts in cerebral ischemia and traumatic brain injury〔J〕.J Neurotrauma，200;17(8):83141.

　　10 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart，improving function and survival〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98(18):103449.