环磷酸腺苷反应元件结合蛋白与血管性痴呆

【关键词】 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白;学习记忆;突触可塑性;长时程增强;血管性痴呆

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是一种重要的细胞核内转录因子，调节启动子中具有环磷酸腺苷反应元件(cAMP response element，CRE)的基因转录。环磷酸腺苷(cAMP)或钙浓度升高等多种信号转导通路可启动CREB的磷酸化并使其活化。CREB具有调节包括学习记忆在内的广泛的生物学功能。现就CREB的活性调控机制及其在血管性痴呆(VD)病理生理机制中的研究进展进行综述。

　　1 CREB结构特点和活化调节机制

　　1.1 CREB结构特点 CREB与cAMP反应元件调节蛋白(cAMP response element modulator，CREM) 、转录活化因子1同为含亮氨酸拉链碱性域(basic regional leucine zipper，bZIP)模体的bZIP超家族成员，具有相似的蛋白质单体结构，均可与CREB靶基因启动子中的CRE位点结合。CREB蛋白单体由341个氨基酸组成，主要含有N端碱性区域、C端激酶诱导区域( kinase induced domain，KID)和亮氨酸拉链模体。N端碱性区域富含正电荷氨基酸，负责CREB与下游作用元件CRE的结合;KID含有多个蛋白激酶的磷酸化识别位点，例如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和钙调节蛋白激酶(calmodulin kinase，CaMK)磷酸化识别位点为Ser133。KID磷酸化是CREB活化的关键条件，活化后的CREB通过一系列机制启动靶基因发生转录。

　　1.2 CREB活化调节机制 磷酸化的CREB激活相关基因的转录，调节某些蛋白质的表达，发挥抑制细胞凋亡和细胞分化再生、细胞损伤后的修复作用。CREB活化的中心环节是Ser133位点的磷酸化，其活化受多种蛋白激酶的磷酸化调节。CREB的经典活化调节通路是G蛋白偶联受体的活化导致细胞内cAMP升高，依赖cAMP的PKA激活，PKA 催化亚基转位入细胞核使CREB磷酸化，CREB磷酸化后暴露出两侧富集谷氨酰胺的Q1、Q2区，促使与其辅助激活因子CREB结合蛋白(CREB binding protein，CBP)上的KIX结构域结合，C端激酶诱导区域与KIX 之间的作用决定了CREB促进其靶基因转录水平。CREB以二聚体的形式结合于基因启动子上游CRE的DNA序列，通过共激活蛋白和P300介导调节多种基因的转录。CREB的转录活性除因脱磷酸作用而失活外，亦可被其家族成员的抑制性异构体阻断，CREM异构体可与活化的CREB竞争CRE位点，但这些抑制性异构体缺乏富含谷氨酸盐的Q域，不能与转录机构相互作用，故只能使CRE启动子保持静止状态。

　　2 CREB磷酸化参与学习记忆过程的机制

　　CREB活化后与真核生物靶基因CRE序列结合并调节其转录，发挥多种生物学效应。CREB磷酸化调控的基因转录涉及包括在代谢、转录、学习记忆、细胞周期调控、细胞信号、生长繁殖发育等多种生物功能中相关的蛋白、因子、受体的大量的功能性基因，其中包括多种重要的神经肽、神经递质及受体或生长因子、信号分子，如:脑啡肽、神经递质受体亚基GluR1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、脑源性神经生长因子(BDNF)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)、N乙酞转移酶、囊泡单胺转运体等。CREB磷酸化正是通过改变靶基因的表达影响学习记忆功能。在中枢神经系统，CREB调节神经元生长发育，参与神经元突触可塑性、长时程记忆(longterm memory，LTM)的形成过程〔1〕。

　　2.1 CREB磷酸化与LTP、双向突触可塑性 突触传递的长时程增强(longterm potentiation，LTP)是哺乳动物中枢神经系统贮存信息的主要机制，是学习记忆的细胞基础，已成为神经元可塑性的一种有效模型。晚期LTP(late phase LTP，LLTP)可持续数小时到数天，需要基因转录及新的蛋白合成，是LTM的重要机制。越来越多动物实验证明CREB在介导LLTP及记忆过程中的不可替代作用。

　　重组表达活性形式的CREB(constitutively active form of CREB，CREBCA)可降低诱导持续性的LLTP的阈值〔2〕。在成年大鼠的培养脑片中，CREB在LTP诱导后的维持期内呈持续的活化状态达4 h，提示CREB磷酸化对LLTP维持也起非常重要作用，特异性地阻断核内活化CREB的重要激酶PKA后CREB磷酸化水平下降，而且出现海马CAI区LLTP障碍〔3〕。另外，新近的证据也支持CREB依赖的转录除增加NMDA受体介导的突触传导外，CREBCA表达还显著增加LTP的幅度与维持时间〔4〕。不同的蛋白激酶，包括胞外信号调节激酶2(extracellular signalregulated kinase 2，ERK2)、PKA、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV (calcium/calmodulindependent protein kinaselV，CaMKIV)等，均可通过磷酸化CREB诱导或促进LLTP，并改善动物的学习记忆功能〔5～7〕。在表达持续活化的CREB转基因小鼠(VP16CREB小鼠)中还发现，活化的CREB可能是通过增加BDNF的表达促进或利于海马LLTP的诱导〔8〕。

　　纹状体已被广泛证实在程序性学习记忆中发挥重要作用。应用CREB缺陷的转基因小鼠，在背侧纹状体中可逆地表达无活性的CREB变异体，发现在皮质纹状体相应部位的LTP及长时程抑制(longterm depression，LTD)均被抑制，并出现多种形式的纹状体相关的学习记忆功能障碍，提示CREB对皮质纹状体的突触双向可塑性也是必不可少的〔9〕。

　　2.2 增加沉默突触数量、新的突触连接生成 有一类突触由于突触后膜只表达NMDA受体而缺乏(或未检测到)AMPA受体，即只有突触结构而没有信息传递功能的突触，即为沉默突触。沉默突触是提供实践依赖型神经元联络的良好物质基础，更多的沉默突触可增加NMDA受体介导的突触反应并增强LTP幅度，对长时程突触可塑性与记忆的巩固可能异常重要。这种沉默突触在静息膜电位下处于功能性静止，在LTP期间突触胞浆膜中插入AMPA受体而转化为有功能的突触，这种转化可能是突触成熟及学习和记忆的基础。

　　在体内重组表达活性形式的CaMKIV与CREB，使NMDA受体介导的突触反应及LTP(幅度与持续时间)增强，应用激光共聚焦对神经元二级树突尖部进行三维重建，还发现每单位树突长度上树突棘数量显著增加;电生理、形态学技术均一致地显示新的沉默突触的产生，因此CREB活化的重要结果之一可能就是突触结构的可塑性〔4〕。

　　应用培养的单一的双向海兔感觉神经元与2个空间上独立或分离的运动神经元形成突触，在突触上预灌注5羟色胺使其到达运动神经元上，发现单一轴突分支可形成长时间分支特异性的易化，后者依赖于CREB磷酸化介导的转录，促使新的突触链接的生成〔10〕。

　　2.3 CREB磷酸化与神经元竞争、选择 竞争是许多生物系统的基本属性，在个体间产生选择性压力。在发育过程中，神经元之间的竞争是必不可少的，CREB参与发育中的脑组织神经元之间的竞争〔11〕;在某种记忆过程中，只有部分合适的神经元参与其中〔12〕，提示神经元之间的竞争可能也是成年脑组织可塑性的机制，即对成年脑组织，选择神经元参与编码记忆也是学习记忆的重要机制。

　　外侧杏仁核(lateral amygdala，LA)神经元可塑性是听觉相关性恐惧记忆的必要条件。虽然约70%LA神经元得到传入信息，但只有1/4 神经元存在听觉条件诱导的可塑性，同时，相同比例的LA神经元出现CREB活化，即CREB促使那些神经元被选择参与学习记忆过程。CREB功能缺陷的转基因小鼠表现为发育中及成年脑组织的神经元可塑性障碍，出现包括听觉相关的恐惧记忆功能明显减退，给予内源性CREB(功能正常的CREB)微注射于LA后，相应的记忆障碍得到恢复，证明CREB可以增加神经元的兴奋性，使神经元被选择进入记忆过程〔13〕。

　　2.4 CREB磷酸化与神经元发育、分化、存活 在海马前体细胞瘤株H197细胞的体外实验中证实，CREB磷酸化后，促使CREB介导的下游基因转录而介导了中枢神经系统海马前体细胞的神经元分化〔14〕。动物实验表明CREB磷酸化与神经元分化平行，表现为在小鼠神经元切线方向迁移的晚期阶段增高并在树突伸长及棘突形成后下降;在体外抑制CREB功能可引起神经元形态学分化障碍;而缺乏CREB的转基因小鼠出现新生神经元存活下降〔15〕。即使在成年动物，CREB磷酸化对哺乳动物脑组织神经元的存活也是必不可少的〔16〕。其他多个重要实验也证实CREB对神经元存活的异常重要的作用:脑内CREB功能减退将导致成熟神经元出现显著凋亡，海马及背外侧纹状体神经元退行性变、轴突生长与投射障碍〔17，18〕。

　　3 CREB在VD病理生理变化过程中的作用

　　VD是脑血管病引起的获得性智能损害综合征，学习和记忆障碍是其主要表现。脑的学习记忆功能是一个相当复杂的生理过程，目前认为其中枢主要在海马。学习和记忆的神经生物学基础是突触可塑性，研究显示，VD所表现的学习记忆损伤与突触功能的改变密切相关〔19〕，但目前对本病的病因、病理机制研究尚无完整而统一的认识。在中枢神经系统，CREB调节着神经细胞生长发育，参与神经细胞突触可塑性、LTM过程的形成。CREB的异常表达及活性变化参与了VD的病理生理过程。

　　海马内尤其是CA1区神经元丧失是VD的显著病理特征之一。海马部位神经元包含突触和非突触的NMDA受体，两者对神经元作用相反。突触NMDA受体引起CREB的磷酸化，为神经元提供保护作用;相反，非突触的NMDA受体与CREB磷酸化的关闭通路相耦联，其受体激活后启动CREB的关闭机制，使细胞线粒体膜电位缺失和细胞坏死。谷氨酸NMDA受体兴奋毒性和氧化应激是神经变性的主要机制，这与CREBDNA结合减少、核因子κB (NFκB)DNA结合增加有关〔20〕。CREB对成熟和未成熟神经元的存活不可缺少，具有重要的神经元保护作用〔21〕。通过同源重组敲除CREB基因证实了CREB及其相关因子在哺乳动物神经发育中的作用，CREB和CREM基因敲除小鼠多死于围生期，与CNS神经元大量缺失有关，这种神经元的缺失由妊娠中期多种神经元发生凋亡引起，缺乏CREB和CREM的小鼠在出生后前脑中出现随年龄相关性的神经变性病变〔17〕。Ao等〔16〕研究发现，在成年小鼠前脑中过度表达的CREB突变体能诱导神经元变性，表明CREB磷酸化活性对哺乳动物脑神经元存活有重要作用。研究还发现，VD患者海马组织cAMP水平下降，CREB、磷酸化的CREB 表达量也相应下降;伴随凋亡蛋白诱导因子表达升高，从而诱导神经元的凋亡过程。Nagakura、Takeo等〔22，23〕在注射微球造成大鼠多发性脑梗死性痴呆研究中发现，海马区磷酸化的CREB水平降低及CREDNA结合能力的下降是导致大鼠空间学习记忆能力损害的主要机制。由于CREBCBP信号在记忆形成和神经元成活中的重要性以及CBP在神经变性疾病中的作用，推测CREBCBP活性下降可能构成VD的发病机制。

　　脑缺血和反复缺血再灌注损伤是导致VD的主要病理基础。近年来发现，CREB不仅参与了脑缺血损伤过程，而且CREB介导的转录调节也是参与脑缺血后学习记忆功能改变的主要机制之一。在大鼠脑缺血及再灌注损伤模型，PCREB的表达在很大程度上减少了海马CA1区神经元的丢失，且与CREB的磷酸化水平呈正相关〔24〕。Jin等〔25〕研究发现，脑组织缺血损伤后，海马CA1区磷酸化的CREB及CBP的表达显著增加依赖于CREB的转录调节，介导了脑缺血损伤过程中神经元的保护机制。

　　脑缺血后再灌注产生缺血耐受，能减轻随后较长时间的脑缺血损伤，缺血预适应可诱导脑缺血耐受形成而发挥神经保护作用，但保护机制至今尚不明确。Hara等〔26〕在研究沙土鼠急性全脑缺血预适应模型及体外培养的NG10815缺氧预适应模型中发现，依赖于CREB的转录调节过程介导了脑缺血预适应保护机制的产生;加入CRE诱饵寡核苷酸(decoy oligonucleotide)后CRE与其靶基因的结合活性降低了38%;海马CA1区神经元的生长率降低了21%。在大脑中动脉栓塞致急性局灶性脑缺血损伤过程(MCAO)，30 min预适应处理后，bcl2蛋白的表达增加抑制了神经元凋亡，利于神经元生长存活，发挥神经保护作用。该机制中bcl2基因的转录依赖于CREB磷酸化水平，应用CRE诱饵寡核苷酸后bcl2的表达被阻断，无法发挥缺血预适应保护作用〔27〕。

　　4 CREBCBP信号可能成为治疗VD的靶目标

　　增加CREBCBP通路活性可能成为治疗VD的有效方法。目前以CREBCBP通路为靶目标的药物主要有磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂(phosphodiesterase inhibitors Ⅳ，PDE4)和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。

　　4.1 PDE4 PDE4水解cAMP转化为AMP，因此抑制PDE4是增加cAMP 依赖性CREBCBP信号的一种途径。近年来许多研究认为PDE4抑制剂可通过抑制磷酸二酯酶的活性，降低cAMP的水解，从而参与调控哺乳类动物的记忆与学习等生理过程。PDE4抑制剂咯利普兰(rolipram)能减弱由局灶性脑缺血所致的学习记忆功能障碍，药物效应部分与激活cAMP/PKA/CREB信号转导系统有关〔28〕。洛利普兰能增加CREBDNA结合能力，降低谷氨酸兴奋毒性〔20〕。研究显示洛利普兰能改善淀粉样前体蛋白( amyloid precusor protein，APP)和早老素1(presenilin1，PS1)转基因小鼠CREB磷酸化、LTP及多种形式记忆的损害〔29〕，PDE4抑制剂能逆转CBP+/-或CBP-/-小鼠LTM或LTP 缺损〔30〕。上述研究结果提示PDE4抑制剂可能成为治疗包括VD在内的与记忆丧失有关的神经病变的药物。

　　4.2 组蛋白脱乙酰基酶抑制剂 这类药物能增强CBP的组蛋白乙酰转移酶活性效应，而CBP的组蛋白乙酰转移酶对LTM形成有重要作用。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂能增加野生型小鼠LTP，改善CBP/小鼠L TP 和记忆障碍〔30〕。在AD转基因小鼠模型中，给予组蛋白脱乙酰基酶抑制剂能改善脑形态学特征，提高生存率，增加体重和改善运动功能〔31〕。

　　综上，分子遗传学和分子生物学实验证实了CREB在神经元生长发育、神经突触形成及学习记忆功能方面的作用。近年来，其活性调控机制得到进一步的研究，许多因素刺激了CREB的活化，多种信号通路参与了CREB的活性调控，而且各调节因子之间、通路之间存在着交叉联系和相互作用，共同维持着CREB活性的平衡。在中枢神经系统，CREB调节着神经细胞生长发育，参与神经细胞突触可塑性、长时程记忆过程的形成过程。CREB的异常表达及活性变化参与了VD的病理生理过程。尽管目前尚缺乏治疗VD的有效方法，但通过对动物模型构建研究分析，在其治疗方法研究中已取得重要进展，针对CREBCBP通路为靶目标的药理学方法在动物模型中的结果显示CREB可能用于VD治疗。对记忆形成机制、突触可塑性和神经元分子机制水平以及CREB通路作用机制进一步深入研究可找到更好的治疗VD的方法。

参考文献

　　1 Leutgeb JK，Frey JU，Behnisch T.Single cell analysis of activitydependent cyclic AMPresponsive elementbinding protein phosphorylation during longlasting longterm potentiation in area CA1 of mature rat Hippocampalorganotypic cultures〔J〕.Neuroscience，2005;131(3):60110.

　　2 Barco A，Alarcon JM，Kande1 ER.Expression of constitutive active CREB protein facilitates the late phase of longterm potentiation by enhancing Synaptic capture〔J〕.Cell，2002;108(5):689703.

　　3 Matsushita M，Tomizawa K，Moriwaki A.A higeefficiency protein transduction system demonstrating the role of PKA in longlasting longterm potentiation〔J〕.J Neurosci，2001;21(16):60007.

　　4 Marie H，Morishita W，Yu X，et al.Generation of silent synapses by acute in vivo expression of CaMKlV and CREB〔J〕.Neuron，2005;45(5):74152.

　　5 Chen L，Miyamoto Y，Furuya K，et al.PREGS induces LTPin the hippocampal dentate gyrus of adult rats via the tyrosine phosphorylation of NR2B coupled to ERK/CREB signaling〔J〕.J Neurophysiol，2007;98(3):153848.

　　6 Hotte M，Thuault S，Dineley KT，et al.Phosphorylation of CREB and DARPP32 during late LTP at hippocampal to prefrontal cortex synapses in viov〔J〕.Synapse，2007;61(1):248.

　　7 CostaMattioli M，Gobert D，Harding H，et al.Translational Control of hippocampal synaptic Plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2〔J〕.Nature，2005;436(7054):116673.

　　8 Barco A，Patterson S，Alarcon JM，et al.Gene expression porfiling of facilitated LLTP in VP16CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture〔J〕.Neuron，2005;48(1):12337.

　　9 Pittenger C，Fasano S，MazzocchiJones D，et al.Impaired bidirectional synaptic plasticity and procedural memory formation in striatumspecific cAMP response elementbinding proteindeficient mice〔J〕.J Neurosci，2006;26(10):280813.

　　10 Martin KC.Synaptic tagging during synapsespecific longterm facilitation of Aplysia sensorymotor neurons〔J〕.Neurobiol Learn Mem，2002;78(3):48997.

　　11 Mower AF，Liao DS，Nestler EJ，et al.cAMP/Ca2+ response elementbinding protein function is essential for ocular dominance plasticity〔J〕. J Neurosci，2002;22(6):223745.

　　12 Rumpel S，LeDoux J，Zador A，et al.Postsynaptic receptor trafficking under1ying a form of associative learning〔J〕.Science，2005;308(5718):838.

　　13 Han JH，Kushner SA，Yiu AP，et al.Neuronal competition and selection during memory formation〔J〕.Science，2007;316(5823):45760.

　　14 Yang EJ，Yoon JH，Min DS，et al.LIM kinase l activates cAMPresponsive e1ementbinding protein during the neuronal differentiation of immortalized hippocampal progenitor cells〔J〕.J Biol Chem，2004;279(10):890310.

　　15 Giachino C，De Marchis S，GiamPietro C，et al.cAMP response elementbinding protein regulates differentiation and surviva1 of newborn neurons in the olfactory bulb〔J〕.J Neurosci，2005;25(44):1010518.

　　16 Ao H，Ko SW，Zhuo M.CREB activity maintains the survival of cingulate cortical pyramidal neurons in the adult mouse brain〔J〕.Mol Pain，2006;2:15.

　　17 Mantamadiotis T，Lemberger T，Bleckmann SC，et al.Disruption of CREB function in brain 1eads to neurodegeneration〔J〕.Nat Genet，2002;31(1):4754.

　　18 Lonze BE，Riccio A，Cohen S，et al.Apoptosis，axonal growth defects，and degeneration of peripheral neurons in mice lacking CREB〔J〕. Neuron，2002;34(3):37185.

　　19 Selkoe DJ.Alzheimer′s disease is a synaptic failure 〔J〕.Science，2002;298(5594):78991.

　　20 Zou J，Crews F.CREB and NFkappaB transcription factors regulate sensitivity to excitotoxic and oxidative stress induced neuronal cell death〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2006;26(46):385405.

　　21 Chang YC，Huang CC.Perinatal brain injury and regulation of transcription 〔J〕.Curr Opin Neurol，2006;19(2):1417.

　　22 Nagakura A，Takagi N，Takeo S.Impairment of cerebral cAMPmediated signal transduction system and of spatial memory function after microsphere embolism in rats 〔J〕.Neuroscience，2002;113(3):51928.

　　23 Takeo S，Niimura M，MiyakeTakagi K，et al.A possible mechanism for improvement by a cognitionenhancer nefiracetam of spatial memory function and cAMPmediated signal transduction system in sustained cerebral ischaemia in rats〔J〕.Br J Pharmacol，2003;138(4):64254.

　　24 Tanaka K，Nogawa S，Nagata E，et al.Persistent CREB phosphorylation with protection of hippocampal CA1 pyramidal neurons following temporary occlusion of the middle cerebral artery in the rat 〔J〕.Exp Neurol，2000;161(2):46271.

　　25 Jin K，Mao XO，Simon RP，et al.Cyclic AMP response elementbinding protein (CREB) and CREB binding protein ( CBP) in global cerebral ischemia 〔J〕.J Mol Neurosci，2001;16(1):4956.

　　26 Hara T，Hamada J，Yano S，et al.CREB is required for acquisition of ischemic tolerance in gerbil hippocampal CA1 region 〔J〕.J Neurochem，2003;86(4):80514.

　　27 Meller R，Minami M，Cameron JA，et al.CREBmediated Bcl2 protein expression after ischemic preconditioning 〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2005;25(2):23446.

　　28 Nagakura A，Niimura M，Takeo S.Effects of a phosphodiesterase IV inhibitor rolipram on microsphere embolisminduced defects in memory function and cerebral cyclic AMP signal transduction system in rats〔J〕. Br J Pharmacol，2002;135(7):178393.

　　29 Gong B，Ottavio VV，Trinchese F，et al.Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model after rolipram treatment〔J〕.J Clin Invest，2004;114(11):162434.

　　30 Alarcón JM，Malleret G，Touzani K，et al.Chromatin acetylation，memory，and LTP are impaired in CBP + / mice：a model for the cognitive deficit in RubinsteinTaybi syndrome and its amelioration 〔J〕.Neuron，2004;42(6):94759.

　　31 Hockly E，Richon VM，Woodman B，et al.Suberoylanilide hydroxamic acid，a histone deacetylase inhibitor，ameliorates motor deficits in a mouse model of Huntington′s disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(4):20416.