PPARγ在肝外胆管癌中的表达及其意义

　　　　 作者：刘兵 王文斌 王安峰 吕海涛 刘明

【摘要】 目的 观察PPARγ mRNA和蛋白在肝外胆管癌组织中的表达，并探讨其与肝外胆管癌临床病理特征之间的关系。方法 采用RTPCR和Western印迹检测PPARγ mRNA和蛋白在30例肝外胆管癌组织中的表达情况。结果 RTPCR法检测结果显示肝外胆管癌组织中，淋巴结转移组和无淋巴结转移组PPARγ mRNA表达分别为0.47±0.06和0.24±0.07，差异有统计学意义(P<0.01);低分化组和高中分化组PPARγ mRNA表达分别为0.3±0.19和0.17±0.01，差异无统计学意义(P>0.05);Ⅱ、Ⅲ期和Ⅰ期肝外胆管癌组织PPARγ mRNA表达分别为0.63±0.35和0.63±0.28，差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹结果显示肝外胆管癌组织中，淋巴结转移组和无淋巴结转移组PPARγ 蛋白表达水平分别为2.0±0.44和0.93±0.21，差异有统计学意义(P<0.01);低分化组和高中分化组中，PPARγ蛋白表达分别为0.87±0.23和0.96±0.15，差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ期和Ⅰ期，PPARγ蛋白表达分别为2.45±0.54和1.95±0.24，两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PPARγ 可能对肝外胆管癌的发生和发展起促进作用。

【关键词】 PPARγ; 肝外胆管癌;逆转录聚合酶链式反应;免疫印迹

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一类由配体激活的核转录因子，参与调节脂质代谢与糖代谢、脂肪细胞分化和能量平衡、炎症反应、动脉粥样硬化及肿瘤细胞的分化与凋亡等生理和病理过程，其中PPARγ与肿瘤的关系已日益引起人们关注。研究发现，PPARγ位于机体多种信号传导的交叉点，相关文献已经证明PPARγ 配体( pioglitazone，PGZ) 对肝门胆管癌细胞系 QBC939 细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用，从而成为新的肿瘤治疗靶点〔1〕。然而，PPARγ在胆管癌组织中的表达尚无报道。本文利用RTPCR及Western印迹技术检测PPARγ mRNA和蛋白在肝外胆管癌中的表达情况，并探讨其表达与肝外胆管癌临床病理特征的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 手术切除并经病理证实的肝外胆管癌组织30例(腺癌26例，其中高中分化15例，低分化11例;黏液腺癌4例)，男18例，女12例，年龄37～74(平均57.2)岁。术前均未作放疗、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗。Ⅰ期 11例，Ⅱ、Ⅲ期19例。淋巴结转移7例，无淋巴结转移23例。所有患者均取新鲜癌组织标本，取材后迅速投入液氮中冷冻保存。引物由上海生物工程有限公司合成。

　　1.2 RTPCR检测PPARγ mRNA表达 采用异硫氰酸胍一步法提取肝外胆管癌总RNA，反转录合成cDNA。PCR反应：PPARγ 引物序列为正义：5′GCA GTG GGG ATG TCT CAT AAT GC3′，反义:5′CAG GGG GGT GAT GTG TTT GAA C3′，产物长度为328 bp。GAPDH引物序列为：正义：5′GGAAGGTGAAGGTCGGAGT3′，反义：5′CCTGGAAGATGGTGATGGG3′，产物长度为231 bp。反应条件：94℃变性5 min，94℃ 50 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，35次循环后72℃延伸10 min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，90 V，40 min，紫外分析仪中观察并照相，凝胶分析软件定量。采用凝胶分析软件(BIO1D)分析各条带平均灰度值，以PPARγ与内参照基因GAPDH的灰度比值表示PPARγ mRNA相对表达量。

　　1.3 Western印迹检测PPARγ蛋白的表达 冰PBS洗涤后的组织加入蛋白裂解液，匀浆收集上清。蛋白定量后，经10% SDSPAGE后转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭4 h，加入1∶400一抗〔小鼠抗人PPARγ (E8)单克隆抗体，Santa Cruz公司〕4℃过夜，二抗室温孵育1 h 后，ECL发光。以PPARγ与βactin条带的比值表示PPARγ蛋白的表达量。

　　1.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件进行分析;采用单因素方差分析(ANOVA)，数据采用x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 PPARγ mRNA表达与肝外胆管癌临床病理特征的关系 RTPCR检测结果显示：肝外胆管癌组织中，淋巴结转移组和无转移组PPARγ mRNA表达水平分别为0.47±0.06和0.24±0.07，差异有统计学意义(P<0.01) (图1)。低分化组和高中分化组中PPARγ mRNA表达分别为0.3±0.19和0.17±0.01，差异无统计学意义(P>0.05) (图2)。Ⅱ、Ⅲ期和Ⅰ期癌组织PPARγ mRNA表达分别为0.63±0.35和0.63±0.28，差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

　　2.2 PPARγ蛋白表达与肝外胆管癌临床病理特征的关系 Western印迹结果显示肝外胆管癌组织淋巴结转移组和无转移组中PPARγ 蛋白表达水平分别为2.0±0.44和0.93±0.21，差异有统计学意义(P<0.01) (图4)。低分化组和高中分化组中PPARγ蛋白表达分别为0.87±0.23和0.96±0.15，差异无统计学意义(P>0.05) (图5)。Ⅱ、Ⅲ期和Ⅰ期癌组织PPARγ蛋白表达分别为2.45±0.54和1.95±0.24，两组差异无统计学意义(P>0.05) (图6)。

　　3 讨 论

　　肝外胆管癌属于少见的恶性肿瘤，据统计在所有恶性肿瘤中所占比例不足2%，但其发病率有逐渐增多趋势。虽然手术切除为其主要的治疗手段，但是国内近10年的手术切除率仅18%，一般为10%～20%，大多数经手术切除治疗的患者仍死于肿瘤的局部复发〔2〕。在胆管癌的治疗中，放疗及化疗的作用还不肯定。随着分子生物学和分子病理学的发展，已认识到细胞癌变是基因的异常激活或失活所致，肿瘤的基因治疗成为研究热点。

　　PPARγ作为核激素受体超家族中的成员之一，可通过抑制增殖、诱导细胞凋亡及分化、抑制肿瘤血管形成和降低肿瘤侵袭能力等不同机制发挥抗肿瘤作用。由于人类癌症的多样性和复杂性，在不同的肿瘤中，PPARγ经其配体激活后通过多种途径诱导肿瘤细胞的凋亡，研究证实在肝细胞癌、胃癌、结肠癌以及胰腺癌等肿瘤中，诱导细胞停滞在G0/G1期〔3～6〕。而在胆管细胞癌细胞系SG231、CCLP1和HuCCT1的研究中，国外学者Han等〔7〕发现15 dPGJ2(PPARγ的配体)和TGZ在3个细胞系中诱导生长抑制、G2/M阻滞;研究显示吡格列酮作为PPARγ的高亲和力配体可能通过激活PPARγ导致细胞周期进程出现G2/M期阻滞以及诱导细胞凋亡，从而发挥其对胆管癌细胞的生长抑制作用。国内学者同样证明了此观点〔8〕。

　　PPARγ在结肠癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤组织中高表达〔9～11〕。PPARγ在肝外胆管癌中表达的情况及与临床病理的关系尚未见报道。本研究表明，肝外胆管癌组织中存在PPARγ mRNA和蛋白的表达，淋巴结转移组其表达明显高于无淋巴结转移组，提示PPARγ与肝外胆管癌的淋巴结转移相关。PPARγ的表达可能促进了肝外胆管癌组织的淋巴转移过程，但具体机制尚不清楚。而PPARγ mRNA和蛋白的表达与肝外胆管癌组织分化及临床分期无明显相关，与文献中其他肿瘤的表达不尽相同，提示PPARγ所起的作用在不同的肿瘤类型中可能是不同的，亦或是与检查方法不同有关。 PPARγ对肝外胆管癌细胞淋巴转移过程及其他恶性生物学行为的影响需进一步深入探讨，以便为胆管癌的基因治疗及放化疗提供新的依据。

参考文献

　1 程 文，程南生，熊先泽，等.过氧化物酶增殖物激活受体 γ 在肝门部胆管癌中的表达及其配体对胆管癌细胞生长的抑制作用〔J〕.中华实验外科杂志，2005;22(11):1406.

　　2 黄志强.当代胆道外科学〔M〕.上海:科学技术文献出版社，1998:61536.

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　　5 Kitamura S，Miyazaki Y，Shinomura Y，et al.Peroxisome proliferator activated receptor gamma induces growth arrest and differentiation markers of human colon cancer cells〔J〕.Jpn J Res，1999;90(1):7580.

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　　7 Han C，Demetris AJ，Michalopoulos GK，et al.PPARγ ligands inhibit cholangiocarcinoma cell growth through p53dependent GADD45 and p21WAF1/Cip1pathway〔J〕.Hepatology，2003;38(1):16777.

　　8 程 文，程南生，熊先泽，等.PPAR γ在肝门部胆管癌中的表达及其配体激活后对胆管癌细胞的作用〔J〕.四川大学学报(医学版)，2006;37(5):7459.

　　9 DuBois RN，Gupta R，Brockman J，et al.The nuclear ercosanoid receptor，PPARs，is aberrantly expressed in cilonic cancers〔J〕.Carcinogenesis，1998;19(1):4953.

　　10 Zhang GY，Ahmed N，Riley C，et al.Enhanced expression of peroxisome proliferators activated receptor gamma in epithelial ovarian carcinoma〔J〕.Br J Cancer，2005;92(1):1139.

　　11 Sato H，Ishihara S，Kawashima K，et al.Expression of peroxisome proliferatoractivated receptor (PPARγ) in gastric cancer and inhibitory effects of PPARγ agonists〔J〕.Br J Cancer，2000;83(10):1394.