CD32在人肝癌细胞株上的表达

　　　　　　作者：李和军 刘宁 李频 郑祥雄

【摘要】 目的 检测CD32在人肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404 、HepG2上的表达，探索其在肿瘤免疫治疗中的应用价值。方法 分别应用RTPCR方法、流式细胞术检测3种肝癌细胞株上CD32的表达情况，以u937为阳性对照。结果 u937高表达CD32，而肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404 、HepG2未检测到CD32的表达。结论 肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404 、HepG2不表达CD32，应用基因工程方法调节肿瘤细胞上不同亚型CD32的表达，或许可以激发机体抗肿瘤免疫，成为肿瘤免疫治疗的新途径。

【关键词】 CD32;肝癌细胞;肿瘤免疫治疗

CD32是免疫球蛋白IgG受体FcγR中的一种，已有研究表明CD32与肿瘤的发生、发展密切相关，因此调节CD32等FcγR的表达，或许可以成为治疗肿瘤的一条新途径。目前对于肿瘤细胞上CD32表达情况知之甚少，本文利用RTPCR方法及流式细胞术检测肿瘤细胞CD32的表达，为下一步探讨CD32在肿瘤发生发展中的作用及研究治疗肿瘤的新途径奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 胰酶、RPMI1640 和Trizol试剂为GibcoBRL公司产品。胎牛血清为杭州四季青生物技术公司产品。逆转录酶、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品。FITC标记的鼠抗人CD32单克隆抗体(mAb)购自深圳晶美公司。人肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404、HepG2由本院肝胆研究所馈赠，髓系白血病细胞株u937由本院血液病研究所惠赠。

　　1.2 RNA的提取及RTPCR检测CD32片段 引物序列由上海生物工程有限公司合成。上游：5′AAAGGCTGTGCTGAAACTCG3′;下游：5′TGCTTGTGGGATGGAGAAGT3′，PCR产物为400 bp。各细胞株在含200 ml/L胎牛血清的RPMI1640环境中培养36 h。收获细胞，用Trizol试剂提取总RNA，以RTPCR扩增目的基因片段，PCR条件为：94℃变性60 s，55℃退火60 s，74℃延伸60 s，共循环30次。PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳后观察结果。

　　1.3 流式细胞术检测细胞膜表面CD32的表达 用PBA稀释的PE荧光标记小鼠抗人CD32抗体200 μl重悬细胞，4℃静置孵育30 min，离心洗涤后用冷PBS 200 μl重悬细胞，上机检测;以PE标记的小鼠抗人IgG为阴性对照，以u937为阳性对照。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR检测CD32片段 应用RTPCR法扩增CD32膜外段基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，u937细胞株可扩增出1条特异性条带，与预测的结果一致;而肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404、HepG2均未检测到预期的特异性条带。见图1。

　　1.GeneRulerTM 100 bp DNA Marker;2.阴性对照组;3.u937组;4.SMMC7721组;5.BEL7404组;6.HepG2组

　　图1 RTPCR法检测人肝癌细胞株CD32的表达

　　2.2 流式细胞术检测肝癌细胞株CD32的表达 流式细胞术检测显示，u937高表达CD32，表达率为99.6%;而肝癌细胞株SMMC7721(表达率2.94%)、BEL7404(表达率0.98%)、HepG2(表达率0.84%)细胞膜上未检测到CD32的表达。

　　3 讨 论

　　免疫球蛋白IgG受体FcγR包括CD16、CD32、CD64，属Ig超家族。CD32即FcγR Ⅱ，是人IgG Fc低亲和力受体，主要表达于单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、朗罕细胞、B细胞、血小板和胎盘内皮细胞等表面，在介导炎症介质的释放、ADCC、抗原提呈、吞噬或吞饮中发挥作用〔1〕。已证实CD32分为CD32A、CD32B、CD32C 3个亚型，各型之间的主要差别在于胞内区结构不同。其中CD32A为活化型受体，胞内区域包含酪氨酸受体活化基序(ITAM)，与免疫复合物结合后导致酪氨酸磷酸化，激活细胞;而CD32B为抑制性受体，胞内区域包含酪氨酸受体抑制基序(ITIM)〔2〕，与免疫复合物结合后引发基于ITIM信号的级联反应，抑制细胞的活化，甚至诱发细胞的凋亡，两者可共存于同一细胞表面，维持正常的生理平衡，与肿瘤、自身免疫性疾病的发生、发展及治疗相关。既往研究表明，随着B细胞发育成熟，CD32表达逐渐增加，成熟B细胞主要表达CD32B，其与BCR(B细胞抗原受体)交联后，能够抑制BCR诱发的细胞活化，起负性调节作用。而急性B淋巴细胞白血病的幼稚B细胞则主要表达CD32A，用抗CD32抗体与CD32A交联，可以抑制幼稚B淋巴细胞生长〔3〕。近期研究发现，在肿瘤抗原刺激下，缺乏CD16、CD64或缺乏CD32的BALB/c小鼠都可产生针对肿瘤的特异性抗体，但在随后接受肿瘤细胞的刺激时，缺乏CD16、CD64的小鼠仍无法抑制肿瘤的发生，而缺乏CD32的BALB/c小鼠则可以抑制肿瘤的生长，表明IgG Fc受体对于肿瘤的发生、发展有着重要作用〔4〕。也有研究表明，活化型受体的存在是利妥昔单抗(rituximab)和曲妥珠单抗(trastuzumab)在体内发挥抗肿瘤作用所必需的，CD32与人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体治疗CD20阳性的淋巴瘤的机制有关〔5〕。因此调节CD32等FcγR的表达，或许可以成为治疗恶性肿瘤的一条新途径。

　　在本研究中，RTPCR及流式细胞技术均检测到u937高表达CD32，与既往的研究一致，表明两种方法可正确检测细胞CD32的表达。而在人肝癌细胞株SMMC7721、BEL7404、HepG2 上均未检测到CD32的表达，表明这3种肝癌细胞株均未表达CD32。既往的研究已经表明，肿瘤在体内的免疫逃避是肿瘤无限制生长的重要机制，如何激发机体的抗肿瘤免疫是免疫治疗肿瘤的研究热点。CD32作为一种Ig Fc受体，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，因此利用基因工程技术调节肿瘤细胞不同亚型CD32的表达，或许可以有效激发机体的抗肿瘤免疫，值得进一步研究。

参考文献

　　1 龚非力.基础免疫学〔M〕.武汉：湖北科学技术出版社，1998：4067.

　　2 van den HerikOudijk IE，Capel PJ，van der Bruggen T，et al. Identification of signaling motifs within human Fc gamma RⅡa and Fc gamma RⅡb isoforms〔J〕.Blood，1995;85(8):220211.

　　3 Suzuki T，CoustanSmith E，Mihara K，et al.Signals mediated by Fc_RⅡA suppress the growth of Blineage acute lymphoblastic leukemia cells〔J〕.Leukemia，2002;16(7):127684.

　　4 Lowe DB，Shearer MH，Jumper CA，et al.Fc gamma receptors play a dominant role in protective tumor immunity against a virusencoded tumorspecific antigen in a murine model of experimental pulmonary metastases〔J〕.J Virol，2007;81(3):13138.

　　5 Flieger D，Renoth S，Beier I，et al.Mechanism of cytotoxicity induced by chimeric mouse human monoclonal antibody IDECC2B8 in CD20expressing lymphoma cell lines〔J〕.Cell Immunol，2000;204(1):5563.