人前列腺癌PC3细胞亚群的分离及其生物学行为分析

　　　　 作者：曲珊珊 李荣贵 苏学今 张海英 王洋 李玉林

【摘要】 目的 研究人前列腺癌PC3肿瘤细胞系中是否存在具有干细胞特征的细胞亚群，并对其形态及克隆生长特征进行分析，同时探讨染料Rho123着色强度是否可用于区分不同的肿瘤细胞亚群。方法 采用Rho123染色后流式细胞仪分析;Rho123与DAPI复染后荧光显微镜下形态学观察及细胞克隆生长特征分析等方法。结果 PC3细胞中存在对Rho123着色显著差异的两类细胞亚群，其形态结构、增殖能力及克隆生长方式均有明显差别。结论 人前列腺癌PC3细胞系中存在具有干细胞特性的细胞亚群，对Rho123拒染的特性可用于区分肿瘤干细胞与其他肿瘤细胞。

【关键词】 前列腺癌;罗丹明123;肿瘤干细胞

　　【Abstract】 Objective To identify the characteristic of cancer stemlike cells in prostatic carcinoma PC3 cell line， and analyze the morphous and clone growth， investigate the method of discriminating the different tumor cell subpopulation by Rhodamin123 dye. Methods The PC3 cells stained with Rhodamin123 dye were analyzed by flow cytometry; the cells morphous and clone growth stained with Rhodamin123 and DAPI were observed by fluorescent microscope. Results Two different tumor cell subpopulation existed in PC3 cell line， and the morphous， reproductive activity and colon growth were significantly different in the two cell subpopulation. Conclusions Cancer stemlike cell subpopulation exists in prostatic carcinoma PC3 cell line， the character of some cells excluding Rhodamin123 dye can be used to discriminate tumor stem cells and other tumor cells.

　　【Key words】 Prostatic carcinoma; Rhodamin123; Cancer stemlike cells

　　 研究表明，肿瘤细胞群体中只有一小部分细胞具有形成新肿瘤的能力而被称为肿瘤起始细胞(tumorinitiating cell，TIC)，由于具有自我更新和分化潜能也被称为癌干细胞(cancer stem cell，CSC)。这部分细胞的显著特征是具有极强的潜在增殖、侵袭和迁移能力，对辐射和化疗药物不敏感，是肿瘤转移和复发的根源〔1〕。迄今已先后在白血病及乳腺癌、神经胶质瘤、结肠癌等实体肿瘤中证实了CSC的存在，并发现了一些CSC的生物标志物。但CSC生物标志物也为正常组织干细胞所共有，而且分离后培养极易分化。因此迫切需要寻找一条CSC分离的捷径。罗丹明(Rho)123为亲脂性荧光染料，可快速通过细胞膜，在细胞内主要分布于带负电荷的线粒体基质。高表达ABCG2/BCRPl的细胞可连续将Rho123泵出细胞而拒染，Rho123弱染的特征已被成功用于分离白血病干细胞〔2〕。本研究利用细胞对Rho123着色差异这一特征，采用流式细胞术分析前列腺癌PC3细胞是否存在Rho123高与低染色亚群，并比较两个亚群的差异性，探讨Rho123淡染细胞是否具有CSC特性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人前列腺癌细胞株PC3 为吉林大学白求恩医学院病理教研室保存，F12培养基为Gibco产品，标准胎牛血清购自天津血液病研究所，胰蛋白酶为Amresco产品，Rho123、DAPI购自碧云天公司。

　　1.2 仪器 荧光倒置显微镜为Leica公司产品，倒置显微镜为Olympus公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。

　　1.3 细胞Rho123染色强度的流式细胞分析方法 细胞培养在含10%胎牛血清的F12培养基中，置于5%CO2、37℃孵箱培养。待细胞达到指数生长期，常规胰酶消化，3次PBS清洗后，制成单细胞悬液(1×107细胞/ml)。等分细胞悬液，一组为背景对照，另一组加入Rho123染料至终浓度为2 μmol/L，37℃避光孵育30 min(每10 min将细胞轻轻悬起)，再经PBS清洗2次，最终将细胞重悬于500 μl PBS溶液。经200目滤网过滤后进行流式细胞仪分析，激发光波长为507 nm，每组分别检测1×104个细胞。

　　1.4 细胞Rho123染色后凋亡检测 取指数生长期细胞常规消化、制备成单细胞悬液，调整密度为5×105个/ml，取500 μl细胞悬液滴至24孔培养板中的盖玻片上，放入培养箱中过夜。次日吸去培养基，PBS洗2次，加入无血清F12培养基，再加入Rho123至终浓度为2 μmol/L，37℃避光孵育30 min，在孵育10 min时再加入DAPI染色液至终浓度为0.5 μg/ml。期间每隔10 min轻轻震荡1次，吸去染色液，PBS洗2次，分别于507 nm、340 nm波长激发Rho123与DAPI，荧光显微镜下观察染色情况，分析淡染细胞核状态是否为凋亡细胞。

　　1.5 细胞克隆及生长特征比较分析 取指数生长期细胞常规消化，吹打成单细胞悬液，调整密度至10个/ml，取0.1 ml细胞悬液滴加至96孔培养板中，次日进行Rho123染色，倒置显微镜下观察，挑选只含有1个细胞的孔，标记Rho123淡染细胞。培养到第14天时再进行Rho123染色，观察克隆形成情况及染色情况。

　　2 结 果

　　2.1 前列腺癌PC3细胞中存在Rho123着色不同的细胞亚群 染料Rho123结合流式细胞术观察PC3细胞系中Rho123淡染细胞的比例。结果显示，背景对照组的PC3细胞系无自身荧光，经Rho123染色后出现明显的双峰，且两峰内细胞的荧光差异较明显，经重复后结果一致，即PC3细胞中存在淡染和深染两种亚群细胞。见图1。

　　图1 PC3细胞Rho123染色流式细胞仪分析图

　　2.2 Rho123淡染细胞群并非凋亡细胞 Rho123为亲脂性分子，可快速通过细胞膜，因其带阳电荷，进入细胞后，主要分布在细胞内带负电荷的线粒体基质。处于凋亡中的细胞，因其线粒体膜电位降低也会出现Rho123淡染。因此，本研究对上述研究中的淡染细胞进一步行Rho123DAPI复染，在荧光显微镜下分析其形态学变化，结果发现PC3细胞中大部分胞浆被Rho123染色呈现红色荧光(图2A)，少部分细胞胞浆红光较弱(图2B)，Rho123淡染及深染细胞胞核被DAPI染色呈均匀一致的蓝色，没有核染色质螺旋皱缩的凋亡现象，即Rho123淡染的细胞并不是凋亡细胞。

　2.3 两亚群细胞具有不同的形态结构、增殖能力、集落生长方式 为观察Rho123淡染细胞亚群的单个细胞增殖能力及增殖细胞的特点，进行了克隆形成实验。细胞培养至第14天，镜下可见Rho123深染细胞分裂增殖产生的细胞几乎全为Rho123深染，且细胞之间排列比较松散;Rho123淡染细胞分裂增殖产生的细胞绝大部分为Rho123淡染细胞，细胞间排列较紧密(图3)，且Rho123淡染细胞增殖能力明显强于Rho123深染细胞。

　　3 讨 论

　　1996年Goodell等〔3〕利用DNA染料Hoechst33342为鼠造血干细胞染色并进行荧光活化细胞分选系统(fluorescence activated cell sorting，FACS)分选时，发现一小群具有弱荧光染色特性的细胞呈彗星状分布在主群细胞的一侧，他们将这群细胞称为侧群(side populmion，SP)细胞，也称边群细胞，SP细胞的这种弱染色表型称为SP表型。近年来在成体多种组织、胚胎甚至肿瘤细胞中都发现了SP细胞〔4，5〕，他们同源性高，具有自我更新和分化潜能，在体内能够分化产生不同组织类型的细胞〔6，7〕，表明SP细胞具有类似于干细胞的自我更新和多向分化潜能，在一定程度上可以代表干细胞作为研究干细胞的重要资源，尤其在一些表面标志未知的CSC。因此分离CSC，对其生物学特征及在肿瘤发生和进展中作用的研究，以及寻找CSC生物标记物，以其为靶点进行靶向治疗已成为肿瘤生物学研究及防治研究的新热点。

　　国外研究者在脑肿瘤和乳腺癌中做了初步尝试，多借鉴正常干细胞的分离方法，包括细胞表面标志、球形培养和SP分离等〔8〕。某些癌细胞和干细胞能通过细胞表面的P糖蛋白将进入胞内的Rho123主动外泵至胞外，表现为低荧光的特征，可分选为Rho123低染和Rho123深染两个亚群。本研究发现，前列腺癌PC3细胞对Rho123染料着色不同，即PC3细胞中存在Rho123淡染的亚群细胞，1×104个细胞中约占7.2%，且经DAPI染色发现这些Rho123淡染的细胞并非细胞凋亡所致。进一步的克隆形成实验证实，Rho123淡染细胞形成的克隆细胞排列紧密，细胞形态大小一致，并且分裂增殖能力明显强于Rho123深染细胞，即前列腺癌PC3细胞中存在具有干细胞特性的细胞亚群。

　　本研究利用流式细胞仪结合Rho123染料分离干细胞，不需使用昂贵抗体及繁杂的染色步骤，操作简单，且对细胞无毒性，是一种经济有效的分离方法。并初步证实了前列腺癌中有干细胞特性的细胞存在，说明某些肿瘤细胞对Rho123拒染的特性可用于CSC的分离。

参考文献

　1 Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells 〔J〕.Nature，2001;414(6859)：10511.

　　2 Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell〔J〕.Nat Med，1997;3(7)：7307.

　　3 Goodell MA，Brose K，Paradis G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo〔J〕.J Exp Med，1996;183(4)：1797806.

　　4 Habich A，Jurga M，Markiewicz I，et al.Early appearance of stem/progenitor cells with neurallike characteristics in human cord blood mononuclear fraction cultured in vitro〔J〕.Exp Hematol，2006;34(7)：91425.

　　5 Samuel J，HaIt C，Gilmore P，et al.Enrichment of the prostate side population the quest for the pfostate epithelial stem cell〔J〕.Eur Urol Suppl，2006;5(1)：62.

　　6 Hirschmann JC，Foster AE，Wulf GG，et al.A distinct“side population”of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004;101(39)：1422833.

　　7 Challen GA，Little MH.A side order of stem cells：the SP phenotype〔J〕. Stem Cells，2006;24(1)：312.

　　8 张 月，张凤春，张雁云.乳腺癌MCF27肿瘤细胞SP亚群初步分析〔J〕.上海交通大学学报(医学版)，2006;26(5)：50710.