不同方式的低能量激光照射对MG63细胞周期和细胞凋亡的影响

　　　　　　作者：李秋实 周延民 曲世华

【摘要】 目的 探讨不同方式的低能量激光照射(LLLI)对MG63细胞周期和细胞凋亡的影响。方法 将对数生长期的人成骨样细胞MG63随机设为3组，采用GaAlAs半导体激光器(808 nm，66 mW)进行照射。照射Ⅰ组照射3 d，每天照射剂量1.25 J/cm2;照射Ⅱ组照射1 d，照射剂量3.75 J/cm2;两组的照射总剂量均为3.75 J/cm2;对照组不进行激光照射。照射后72 h，采用流式细胞术分别检测各组的细胞周期和细胞凋亡率。结果 与对照组相比，照射Ⅰ组和照射Ⅱ组的S期细胞数增加，G1期细胞数减少，细胞增殖指数增加(P<0.05)，且两个照射组之间无明显差异(P>0.05)。与对照组相比，照射Ⅰ组和照射Ⅱ组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，且两个照射组之间无明显差异(P>0.05) 。结论 总剂量为3.75 J/cm2的LLLI可以通过改变细胞周期时相促进细胞增殖，并能抑制细胞凋亡。在相同的照射剂量下，多次照射和单次照射无明显差别。

【关键词】 低能量激光照射;MG63;细胞周期;细胞凋亡

低能量激光照射(low level laser irradiation，LLLI)近年来已成为临床上广泛应用的治疗手段，用以促进组织愈合过程、治疗功能紊乱、减少疼痛等。LLLI的机制尚未完全清晰，有文献报道LLLI可以调节细胞代谢进而提高生物组织的修复能力〔1〕。现在已知LLLI的光生物调节作用受多因素影响，如波长、照射剂量、照射方式等〔2〕。关于LLLI对体外培养细胞的细胞周期和细胞凋亡的研究很少，且研究对象多为鼠嗜铬细胞〔3〕、正常人皮肤的成纤维细胞〔4〕、人肺腺癌细胞等〔5〕，未见关于人成骨样细胞MG63的研究。本研究旨在观察LLLI对MG63细胞凋亡和细胞周期的影响，并比较不同照射方法的LLLI对MG63的生物学效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂 HDMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(天津灏洋公司)，胰酶(鼎国生物技术公司)，细胞DNA含量检测试剂盒(凯基生物)。

　　1.2 细胞培养和激光照射 人成骨样细胞MG63细胞株购自北京早稻田公司，接种于含10%胎牛血清的HDMEM中。在5%CO2孵育箱内37℃恒温培养，2 d换液，3 d传代1次。低能量半导体激光器(GaAlAs)系中国科学院长春光学机械精密研究所研制，波长808 nm，光束由0.4 mm的光纤探头传输，光电转换效率为33.3%，输出功率为66 mW，功率密度为8 mW/cm2。实验随机设3组:照射Ⅰ组(L1)、照射Ⅱ组(L2)和对照组(C)。L1为多次照射组，连续照射3 d，每天照射剂量为1.25 J/cm2。L2为单次照射组，第1天照射剂量为3.75 J/cm2，第2天、第3天未处理。两组对应的总剂量均为3.75 J/cm2。C组不进行激光照射。第4天收集3组细胞，用以检测细胞周期和细胞凋亡率。

　　1.3 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率 将细胞培养瓶内对数生长期的细胞胰酶消化，离心，收集细胞。用PBS洗涤细胞1次，离心2 000 r/min，5 min，收集并调整细胞浓度为1×106/ml。制备的单细胞悬液用体积分数为70%的乙醇固定，4℃过夜，染色前用PBS洗去固定液。加入100 μl RNaseA 37℃水浴30 min。再加入400 μl 碘化丙啶染色混匀，4℃避光30 min。上机检测(BD FACS Calibur，美国)，记录激发波长488 nm处的红色荧光。此过程重复3遍。

　　1.4 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件，数据以x±s表示，多组间差异的显著性检验用方差分析，两组间差异的显著性检验用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 LLLI对细胞周期的作用 与对照组相比，两个照射组的S期细胞数增加，G1期细胞数减少，细胞增殖指数(PI=S+G2/G1+S+G2)增加，有显著性差异(P<0.05)，而两个照射组间各项指数无明显差异(P>0.05)，见表1。提示低能量激光照射可以影响细胞周期时相，进而促进细胞增殖。

　　2.2 LLLI对细胞凋亡的作用 L1组、L2组、C组的凋亡发生率分别为(10±1.54)%、(11±1.35)%、(22±1.67)%。与对照组相比，两个照射组细胞凋亡率降低，有显著性差异(P<0.05)，而两个照射组间细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)，提示低能量激光照射可以抑制MG63凋亡。表1 LLLI对不同组别细胞周期时相的影响

　　3 讨 论

　　LLLI具有光生物调节作用，可以产生某种与超声波、针灸等物理因子获得的生物刺激相类似的效应，具有广泛的临床应用前景。已有多种激光器应用于医疗领域，用以减轻疼痛、炎症、水肿，促进伤口、深层组织和神经的愈合〔6〕。本实验所用GaAlAs半导体激光器具有体积小、重量轻、输出功率稳定等特点，近年来被广泛应用于激光医学的研究〔7〕。

　　人成骨肉瘤MG63细胞株是具有成骨细胞表型特征的早期成骨细胞模型〔8〕，可用来研究成骨细胞的特性。以往的研究验证了LLLI可以促进体外细胞的增殖〔9〕。本实验结果显示，两个照射组S期细胞增多，G1期细胞减少，增殖指数高于对照组，且两个照射组之间没有统计学差异，表明总剂量为3.75 J/cm2的不同照射方法的低能量激光可以调控细胞周期的时相，促进细胞增殖，与前人的研究结果一致〔10〕。

　　本实验中，细胞受到单次照射和多次照射72 h后细胞凋亡率两个照射组均低于对照组，且两个照射组之间没有统计学差异。表明总剂量为3.75 J/cm2的不同照射方法的低能量激光均可以抑制细胞凋亡，与前人的研究结果一致。Carnevalli〔11〕认为LLLI积极促进了生物调节，可以作为一种细胞凋亡的抑制因子。Shefer〔12〕的研究证实LLLI可以使肌卫星细胞的细胞凋亡减少。

　　LLLI的光生物调节作用机制不清。现在已知有多个机制在光生物调节中起作用，不同波长和剂量的激光机制不同，而哪一个机制起主导作用是很重要的。光生物调节作用以激光的相长干涉特性、组织中存在偏振敏感物质及电偶极子相互作用为光学基础，最终使线粒体的氧化还原状态发生改变，从而加速了跨膜物质转运，活化某些重要的细胞跨膜信号传递，进而达到了组织修复、减少炎症和神经性疼痛等生物学效应〔13〕。

　　本研究证实总剂量为3.75 J/cm2的LLLI能够明显促进MG63的细胞增殖，抑制MG63的细胞凋亡。此外，在相同的照射剂量下，多次照射和单次照射并无明显差别。

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