衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内吞的影响

　　　　　　 作者：张勇 娄冬梅 康劲松 刘全

【摘要】 目的 通过RNAi沉默AP2μ2亚单位的表达，观察其是否影响AT1R介导的AngⅡ内吞。方法 通过设计构建的AP2μ2 RNAi表达载体，转染H9C2细胞，通过Western印迹验证沉默效果;激光共聚焦显微镜观察沉默AP2μ2基因对AT1R介导的AngⅡ内吞的影响。结果 蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2μ2蛋白表达的影响，可见pSH1SiAP2 plasmid1表达质粒可明显抑制AP2μ2蛋白表达。给予AngⅡ不同时间点，可见其在15 min时受体内吞至胞内数量最多。重组质粒沉默AP2μ2亚单位后，外源加入AngⅡ后，可明显抑制AT1R介导的AngⅡ内吞。 结论 AT1R介导AngⅡ内吞的发生，与其他GPCR一样，主要通过网格蛋白依赖的内吞方式进行，并且需要AP2蛋白参与。

【关键词】 衔接蛋白2;内吞;血管紧张素Ⅱ;AT1R

受体介导的内吞(Receptormediated endocytosis)是目前公认的生物体摄取细胞外大分子的主要途径。近年发现G蛋白偶联受体(GPCRs)的内吞对受体功能调节亦非常重要。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和其GPCRs血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)一直被认为介导了心血管疾病和代谢性疾病的终末器官损害〔1〕，二者在细胞膜上结合后通过受体内吞的形式进入细胞内。近年来，人们在探讨肾素血管紧张素系统(RAS)对靶器官和组织病理生理作用的细胞内信号转导机制时，认为AngⅡ与AT1R除在细胞膜上结合激活下游信号转导，二者还可能通过AT1R介导的内吞进入细胞内继续发挥生物学作用。

　　衔接蛋白2(Adaptor protein 2，AP2)是细胞膜表面最主要的衔接蛋白，由2个大亚基(α和β2)，一个中亚基(μ2)和一个小亚基(σ2)组成〔2〕。有研究报道用siRNA技术抑制AP2 μ2亚单位的表达可明显抑制转铁蛋白受体(Transferrin Receptor)的内吞〔3〕。转铁蛋白受体与AT1R同为GPCRs，提示AP2是否也参与了AT1R介导的AngⅡ内吞的过程。因此，本实验通过RNAi技术沉默AP2 μ2亚单位的表达，观察是否影响AT1R介导的AngⅡ内吞，为进一步研究AngⅡ与AT1R在细胞内的信号转导作用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和试剂 AngⅡ抗体由日本大阪医科大学药理教研室的金德男教授惠赠;βactin和荧光二抗等抗体购自美国SANTA CRUZ公司;AP2μ2抗体(AP50)购自美国BD公司。溴化乙锭、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N-二甲基双丙烯酰胺、PMSF购自美国Sigma公司;DAB、TritonX100、Tween20购自北京鼎国生物技术有限公司;胰酶、DMEM培养基为美国Hyclone公司产品;小牛血清购自美国Gibco公司;蛋白酶抑制剂购自大连宝生物工程公司;其他常规化学试剂均为分析纯产品。大鼠心肌细胞株H9C2购自中国科学院细胞库。

　　1.2 方法

　　1.2.1 蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2μ2蛋白表达的影响 在前期实验中，本实验室已经成功构建了3条AP2μ2基因siRNA表达载体(pSH1Si AP2)(论文待发表)，经测序未见错配和丢失碱基。在6孔板中完成pSH1Si AP2表达质粒向H9C2细胞的转染，提取细胞总蛋白，Western 印迹检测AP2μ2蛋白表达。将细胞分为正常对照组、阴性对照组、AP2 plasmid1组、AP2 plasmid2组、AP2 plasmid3组共5组。以βactin表达水平作为等量蛋白质上样对照，取60 μg蛋白质样品进行SDSPAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上;室温封闭2 h后，用含0.01% Tween20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次，每次10 min;加入相应的AP2μ2抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，37℃摇床温育2 h，最后经DAB显色，凝胶图像分析系统分析蛋白的表达。

　　1.2.2 给予AngⅡ不同时间点观察其在H9C2细胞内的内吞变化过程 将合适尺寸的盖玻片高压灭菌，放入24孔板内，种入适宜的细胞浓度。待细胞融合度达到60%～70%时，，加入AngⅡ 10-7 mol/L，分别于5、15、30和60 min终止药物作用，4%多聚甲醛固定30 min。1%TritonX100作用10 min;PBS洗3次，5 min/次;3%h3O2室温10 min，PBS洗3次，5 min/次;非免疫动物血清，室温15～20 min，倾去多余液体，不洗，滴加特异性一抗，室温半小时，然后4℃过夜。PBS洗3次，5 min/次。滴加荧光二抗，避光室温10～15 min，PBS洗3次，5 min/次。甘油封片剂封片固定，在激光共聚焦显微镜下观察并照片。

　　1.2.3 观察siRNA重组质粒沉默AP2μ2亚单位对AT1受体介导的AngⅡ内吞的影响 将合适尺寸的盖玻片高压灭菌，放入24孔板内，种入适宜的细胞浓度。待细胞的融合度达到60%～70%时，正常对照组不做任何处理，阴性对照组只加入AngⅡ 10-7 mol/L作用15 min，转染pSH1SiAP2 plasmid1质粒24 h。加入AngⅡ 10-7 mol/L，15 min，其中AP2 plasmid1组细胞在加AngⅡ前30 min，加苯砷氧化物(PAO)，0.25 μmol/L，而不转染质粒。AP2 plasmid2组细胞4%多聚甲醛固定30 min。其余方法同1.2.2，最后在激光共聚焦显微镜下观察并照片。

　　1.3 统计学方法 数据均采用x±s表示，采用SPSS11.0统计软件包处理，两两比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2μ2表达的影响 用H9C2细胞及转染pSH1SiAP2、pSH1SiScramble表达质粒的细胞提取总蛋白，经过western印迹法检测细胞中AP2μ2蛋白表达情况。其中转染了pSH1Si AP2 plasmid1的H9C2细胞AP2μ2蛋白的表达明显降低(P<0.01)，说明pSH1Si AP2 expression plasmid1可明显沉默AP2μ2蛋白表达，后续共聚焦观察内吞实验均用此表达质粒转染(图1)。

　　2.2 外源给予H9C2细胞AngⅡ不同时间点其内吞变化 正常H9C2细胞，外源性加入AngⅡ 10-7 mol/L，作用不同时间点(5、15、30和60 min)，激光共聚焦显微镜结果显示：5 min可见H9C2细胞内可见绿色点状荧光出现，15 min时，点状荧光强度最强，持续至60 min时，细胞内的荧光强度达最弱。提示AT1R介导的AngⅡ内吞作用在5 min时就开始发生，15 min时受体内吞至胞内的数量达到最多。因此后续实验选择外源给予AngⅡ10-7 mol/L，作用15 min，来观察细胞内吞情况(图2)。

　　2.3 沉默AP2μ2对H9C2细胞AT1受体介导的AngⅡ内吞的影响 正常对照H9C2细胞胞浆内未见明显点状荧光;未转染质粒的细胞，外源给予AngⅡ 10-7 mol/L，15 min后，胞浆内可见点状绿色荧光;未转染细胞加入0.25 μmol/L PAO，30 min后再加入AngⅡ 10-7 mol/L，15 min后未见胞浆内有点状绿色荧光;细胞转染质粒pSH1SiAP2 plasmid1，转染后24 h加入AngⅡ，15 min后细胞内未见点状绿色荧光，即内吞的AngⅡ(图3)。

　　3 讨 论

　　目前认为RAS与许多心血管疾病联系密切，AngⅡ作为RAS的主要效应因子，除了可调节血管张力和钠盐代谢外，还可以影响心肌细胞的肥大增生，引起心脏收缩功能减弱。抑制增强的AngⅡ活性，已经被公认为是延缓心血管疾病最主要的治疗策略〔1〕。应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和AT1R阻滞剂(ARB)类药物治疗急性心肌梗死后心室重构、改善心功能、降低心力衰竭发生率虽然已取得一些共识，但是ARB对患者心肌重构的远期疗效还存在争议。

　　已知GPCRs的内吞方式主要分为网格蛋白依赖(Clathrindependent)的内吞和非网格蛋白依赖(Nonclathrindependent)的内吞两种方式，且受体与配体内吞方式与细胞类型有关〔4〕。受体与配体复合物在内陷小窝(Coated pits)处浓缩，在AP和其他蛋白质的参与下，网格蛋白聚集装配多聚化成网状，将胞膜拉向胞质侧，形成包被小泡(Coated vesicle)。通过衔接蛋白复合体，网格蛋白连接到胞膜表面，同时AP也参与网格蛋白包被(clathrin coat)的组成〔5〕。

　　AP2是专门参与胞质膜向内体(Endosomes)转化的衔接蛋白〔6〕，目前认为AP2通过识别受体胞内域含酪氨酸的内化基序YXXΦ(其中Y为酪氨酸，X为任一种氨基酸，Φ为大分子疏水氨基酸)，调控受体与配体的内吞过程。其中μ2亚单位可以与生长因子受体的酪氨酸富含区域结合，促进受体与网格包被的联系〔7〕。突变μ2亚单位，影响其对受体的结合，可以抑制受体内吞的发生〔3〕。因此本实验通过RNAi技术沉默AP2μ2亚单位表达，来探讨AT1R内吞是否也需要AP2的参与，进一步探讨AT1R介导AngⅡ内吞的细胞机制。

　　本研究前期实验设计了3个AP2μ2亚单位基因RNA干涉靶位点，并成功构建了RNAi表达载体，经测序没有错配和丢失碱基。将3个RNAi表达载体分别转染H9C2细胞，通过蛋白表达检测，pSH1SiAP2 plasmid1质粒可明显抑制AP2μ2蛋白表达，因此决定应用第一条重组质粒，观察AP2μ2表达抑制对AT1R内吞的影响。另外，外源给予H9C2细胞AngⅡ 10-7 mol/L，作用于不同的时间点(5、15、30和60 min)，发现在5 min时，就已经有AngⅡ内吞的发生，一直持续至60 min，但是在15 min时，细胞内点状绿色荧光强度最强，说明15 min时AngⅡ的内吞入胞内的数量最多。因此后续实验选择在15 min时观察受体介导内吞的改变。

　　通过激光共聚焦显微镜可以观察到，外源加入AngⅡ后，在单纯加药组细胞，AngⅡ与细胞表面AT1R结合后，可以看到明显的内吞过程发生。而在AP2μ2干涉组，细胞内未见绿色荧光颗粒，即内吞的AngⅡ进入细胞内，因此可以判断，AP2μ2亚单位被抑制后，也抑制了AT1R介导的AngⅡ内吞的发生。同时应用PAO组细胞作为阳性对照，未发现有AT1R介导的AngⅡ内吞。因为PAO可以抑制G蛋白偶联受体胞内段酪氨酸激酶活性，进而抑制GPCR内吞的发生〔8〕。

　　通过上述结果分析，AT1R内吞的发生，与其他GPCRs内吞一样，如转铁蛋白受体，主要通过网格蛋白依赖的内吞方式进行，且需要AP2蛋白的参与，并与其他蛋白形成网格蛋白包被，连接到胞膜表面，共同参与了胞膜表面GPCRs的内吞过程。通过这一机制的研究，进一步探讨了AT1R内吞机制和RAS在心血管疾病发病过程中的作用，为探讨RAS对靶器官和组织损伤的病理过程提供理论基础。

参考文献

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　　2 Robinson MS.Coats and vesicle budding〔J〕.Trends Cell Biol，1997;7(3):99102.

　　3 Motley A，Bright NA，Seaman MN，Robinson MS.Clathrinmediated endocytosis in AP2depleted cells〔J〕.J Cell Biol，2003;162(5):90918.

　　4 Li XC，Carretero OA，Navar LG，Zhuo JL.AT1 receptormediated accumulation of extracellular angiotensin II in proximal tubule cells：role of cytoskeleton microtubules and tyrosine phosphatases〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2006;291(2):F37583.

　　5 Schmid SL.Clathrincoated vesicle formation and protein sorting：an integrated process〔J〕.Ann Rev Biochem，1997;66(1)：51148.

　　6 Kirchhausen T.Clathrin adaptors really adapt〔J〕.Cell，2002;109(4)：4136.

　　7 Hunyady L，Catt KJ，Clark AJ，et al.Mechanisms and functions of AT(1) angiotensin receptor internalization〔J〕.Regul Pept，2000;28;91(13):2944.

　　8 Schelling JR，Linas SL.Angiotensin Ⅱdependent proximal tubule sodium transport requires receptormediated endocytosis〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，1994;266(3 Pt 1)：C66975.