ROCKⅡ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定

　　　　　　 作者：李晓江 白云深 杨有庚

【摘要】 目的 构建表达Rho激酶(ROCK)Ⅱ特异性siRNA的重组质粒。方法 按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求，利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件，设计带有BamH I、Bbs I酶切黏性末端、终止识别序列和LOOP环的shRNA，并将其克隆入载体pGPU6/GFP/Neo，构建成ROCKⅡ特异siRNA重组质粒，然后进行酶切鉴定及基因测序。结果 设计的shRNA成功克隆入载体pGPU6/GFP/Neo，构建成ROCKⅡ特异siRNA重组质粒，酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符，目的基因序列准确无误。结论 重组质粒构建成功，为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供了一种有效的方法。

【关键词】 载体构建;RNA干扰;ROCK(Rho激酶)

　　RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。将与靶基因转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(dsRNA)导入细胞后，生成的小干扰RNA(siRNA)与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导的沉默复合物，具有序列特异性核酸内切酶活性，能特异性降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。本研究采用含H1启动子的载体pGPU6/GFP/Neo，针对ras基因超家族中Rho激酶(ROCK)基因的短发夹结构RNA(shRNA)构建靶向ROCKⅡ特异性shRNA真核表达载体，为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供一种有效方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料、试剂与仪器 生化培养箱、震荡培养箱(金坛仪器厂)，荧光显微镜(OLYMPUS公司)。连接试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司)，限制性内切酶(TaKaRa公司)。

　　1.2 shRNA序列设计及合成 根据pGPU6/GFP/Neo中H1启动子启动表达siRNA对序列的要求，利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件、.设计合成4条针对大鼠ROCK序列的siRNA DNA片段，分析获得的序列，选择GC含量在40% ～55% 之间的靶基因序列作为潜在优选，并在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，将选定的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列同源的序列，以确定其为特异性序列。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率，将包含目的siRNA序列的DNA设计为用DNA聚合酶合成的(PCR策略分别设计)包含目的基因siRNA序列的正义链和反义链寡核苷酸序列，在正义链和反义链序列加入间隔序列TTCAAGAGA，以避免形成终止信号，使其能形成发夹结构，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CACC，与Bbs I酶切后形成的黏端互补;反义链模板的5′端添加了GATC，与BamH I酶切后形成的黏端互补;如果siRNA的第1个碱基不是G，则在CACC后补加1个G。随机选取排列序列作为无干扰效果对照序列。编码siRNA的DNA序列由上海生工合成。4条寡核苷酸链及反义链见表1。表1 设计、合成的4对ROCK特异性siRNA位点、寡核苷酸链序列及GC含量

　　1.3 shRNA模板的退火 将DNA oligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100 μmol/L。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系：10×shDNA退火缓冲液5 μl，正义链(100 μmol/L) 5 μl，反义链(100 μmol/L) 5 μl，ddh3O 35 μl，总体积50 μl。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃ 5 min，85℃ 5 min，75℃ 5 min，70℃ 5 min，4℃保存。退火处理后得到浓度为10 μmol/L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20 nmol/L，用于连接反应。

　　1.4 pGPU6/GFP/Neo载体的线性化 取2 μg pGPU6/GFP/Neo载体，按照如下体系进行酶切处理：10×缓冲液G 5 μl，Bbs I 2 μl，BamH I 2 μl，pGPU6/GFP/Neo 2 μg，ddh3O 41 μl，总体积50 μl。37℃酶切1 h，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0 (TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50 ng/μl。

　　1.5 pGPU6/GFP/NeoshRNA载体的构建 按照如下体系进行载体的连接反应：10×T4连接缓冲液2 μl，pGPU6/GFP/Neo(Bbs I+BamH I) 1 μl，shRNA模板(20 nmol/L) 1 μl，T4 DNA连接酶(5 weissU/μl) 1 μl，ddh3O 15 μl，总体积20 μl。22℃ 1 h，转染到JM 109 competent细胞。每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50 μg/ml Kanamycin的LB培养集中。使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamH I、Pst I分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BamH I切开，而不能被Pst I切开。

　　2 结 果

　　重组载体的确切鉴定 见图1。酶切结果表明，所有质粒均为阳性重组载体，每组选择两个克隆进行测序鉴定。测序结果见图2。

　　3 讨 论

　　成年哺乳动物脊髓损伤后轴突难以再生的一个重要原因是在局部环境中存在一些可以抑制轴突再生的生长抑制因子，主要包括3种来源于髓鞘的抑制蛋白:髓鞘相关糖蛋白(MAG)、Nogo、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMGP)〔1〕。这些抑制因子有共同的信号传导通路，均可与Nog的受体NgR结合，在P75的参与下激活其下游的RhoROCK通路而引起生长锥塌陷，抑制轴突的再生。在信号转导过程中，ROCK是该通道的主要成分。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，以两种同源性极高的异构体存在：ROCKⅡ和ROCKI，是目前研究最为清楚的Rho下游效应分子。ROCKⅡ主要表达在脑内，而ROCK I则主要表达在非神经组织如肺、肾和骨骼肌。脊髓损伤ROCK被激活后能够使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，使得肌球蛋白磷酸化程度增高，从而影响肌动球蛋白系统而导致轴突生长锥的塌陷，抑制轴突生长。因此，阻断RhoROCK信号传导通路，即可达到轴突修复与再生的目的。

　　抑制基因表达的方法有很多，目前研究使用较多的主要有基因敲除、反义RNA技术、RNAi技术等，其中RNAi是最近几年发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术，是一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默。与传统的基因治疗方法相比，RNAi技术有着无可比拟的优势〔2～5〕。首先，RNAi基因抑制效果确切，微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上，这样可减少传统基因治疗方法大剂量用药带来的毒副作用及免疫效应。其次，RNAi抑制具有严格的序列特异性，将一段与基因同源的siRNA注入细胞，可以特异地干扰相应基因的表达，而其他基因不会受到干扰，因此，RNAi治疗的针对性强，副作用小。RNAi已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒性疾病、遗传性疾病、肿瘤和脊髓损伤的治疗方面发挥重要作用〔6〕。

　　脊髓损伤的RNAi是在对脊髓损伤后基因表达及产物研究的基础上，通过选择恰当的基因转移途径，在转录后沉默目的基因的表达，阻断抑制因子的作用，进而促进脊髓损伤的修复，达到在分子水平治疗的目的〔7～10〕。选择RNAi沉默ROCKⅡ的基因表达，人为阻断RhoROCK传导通路，有效抑制靶基因表达，使其丧失活性，达到基因控制和基因治疗的目的。因此，本实验筛选出高沉默效率的ROCKⅡ特异性siRNA，并构建其表达载体，为下一步通过RNAi技术直接抑制脊髓损伤后ROCKⅡ的表达做准备。

　　本研究所构建的ROCK特异性siRNA重组质粒pGPU6/GFP/NeoshRNA，经酶切鉴定、基因测序，结果与设计序列完全相符，目的基因序列准确无误，重组质粒构建成功，为进一步研究体内外脊髓损伤的治疗奠定了实验基础。

参考文献

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