福建籍汉族人系统性红斑狼疮的单核苷酸多态性分析

　　　　 作者：陈凌 赵亮 朱进伟 薛士杰 郑祥雄 唐阳

【摘要】 　　目的 筛选系统性红斑狼疮（SLE）遗传易感基因，发现新的易感SNP位点。方法 采用SNP基因芯片与DNA池相结合（SNP microarrays and DNA pools，SNPMaP），在福建籍汉族人群中对240例SLE患者和210例正常对照DNA池分别进行全基因组扫描，通过正态分布法估计正常对照和SLE患者DNA池SNPMaP等位基因频率，用DNA池测序法验证杂合度，用TaqMan法验证单个样本。结果 筛选出108个新的SLE候选易感基因，验证了其中的6个新的易感SNP位点的杂合度，结果与SNP基因芯片结果基本一致，证实rs4731117为一个新发现的易感位点。结论 SNP基因芯片与DNA池相结合的方法是一个实用性好的高通量的SNP筛选工具。rs4731117位点多态性与福建籍汉族人群SLE发病的易感性有一定关系。

【关键词】 红斑狼疮，系统性； 多态性单核苷酸； 芯片分析技术； 福建； 汉族
　　
　　ABSTRACT: Objective To identify new susceptibility loci by screening susceptibility genes for human Systemic Lupus Erythematosus (SLE). Methods In Fujian Han population， 240 SLE patients and 210 controls were employed in the study. The difference of allelic ratio of SNP in patients and controls was assayed by a high throughput method (combining DNApooling and microarray， SNPMaP). The heterozygosity was further validated by DNAsequencing. The samples were inpidually genotyped by realtime PCR (Taqman). Results A total of 108 SNPs was screened to be candidate genetic susceptibility loci for SLE， of which 6 SNPs were further validated. The results of DNAsequencing were consistent with those of SNPMaP. One SNP， rs4731117， was confirmed to be a new genetic susceptibility site for SLE. Conclusion A new method combining SNP microarray and DNApooling (SNPMaP) has been developed to be a high throughout and effective tool. The polymorphism of rs4731117 may be associated with the susceptibility to SLE in Fujian Han population.
　　
　　KEY WORDS: lupus erythematosus，systemic； single nucleotide polymorphisms； DNA pooling； susceptibility
　　
　　系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematous，SLE）是一种累及多系统、多器官的自身免疫性疾病，属于多因素复杂性的疾病，其病因复杂，涉及环境和遗传因素等。根据统计，我国的发病率为70/10万［1］，当前对我国人群中系统性红斑狼疮的遗传易感性的研究尚处于起步阶段。因此，在中国人群中确认和寻找易感基因位点和候选基因具有重大的实践意义。近年来，随着基因芯片技术的快速发展，将单核苷酸多态性与基因芯片相结合的高通量技术已经逐步成为研究基因组学新的工具。但是，由于SNP基因芯片价格昂贵且只能使用一次，这对于大多数研究者筛选成千上万的样本来说并不是经济的。因此，目前理想的解决办法是将SNP基因芯片高通量筛选的优势与DNA池相结合，分析DNA池的基因型，这种方法被称为SNPMaP（SNP microarrays and DNA pools）。笔者就是应用SNPMaP的方法来筛选SLE遗传易感基因，发现新的SLE易感SNP位点。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　240例系统性红斑狼疮（SLE）患者的外周血样品来自福建医科大学附属协和医院和福建省医学科学研究所，所有SLE患者均符合1997年美国风湿病学会（ARA）修定的SLE分类标准［2］。240例中，男性15例，年龄（36±14）岁（13～69岁）；女性225例，年龄（35±12）岁（10～69岁）。选取体检中心的健康人210例为对照组，男性16例，年龄（37±10）岁（24～60岁）；女性194例，年龄（39±13）岁（13～73岁）。对照组和SLE病例组均为无血缘关系的福建籍汉族人群，年龄及性别分布无显著性差异。事先均知情同意。

　　1.2 方法

　　1.2.1 患者DNA池和正常对照DNA池的建立

　　分别从2组个体抽取外周静脉血5 mL，应用试剂盒Blood Genome DNA Extraction Kit(TAKARA BIOTECHNOLOGY(DALIAN) CO.，LTD)提取全血基因组DNA，检测其浓度和纯度，DNA样品稀释至40 ng/μL，每个个体各取DNA样品200 ng，分别构成患者DNA池和正常对照DNA池。

　　1.2.2 高通量SNP芯片筛选DNA池SNP

　　应用高通量SNP芯片GeneChip○R Human Mapping 250K Sty I Array（购自Affymetrix公司）检测SLE患者DNA池和对照DNA池的等位基因，GeneChip Operation software（GCOS）v1.4软件扫描每个基因芯片结果，随后用GTYPE软件分析，确定SNP等位基因在芯片上的杂交信号的实际数值，估计SNPMaP 等位基因频率，计算方法是在OR为1.5的基础上进行。

　　1.2.3 DNA池测序法检测SLE SNP

　　根据筛选结果寻找差异大的SNP进行基因片段的扩增和测序，引物合成和测序由大连宝生物工程公司进行。测序结果用Chromas软件查看，用PowerPoint中的标尺测量各SNP等位基因相应的峰高，OR按测序峰高比值比计算，计算公式如下：
　　
　　OR=hA1/hB1hA2/hB2
　　
　　式中hA和hB 分别表示测序图上该SNP 等位基因A峰和B峰的高度，1表示患者基因池，2表示对照基因池。

　　1.2.4 TaqMan荧光定量PCR法检测SLE易感基因

　　1.2.4.1 应用TaqMan荧光定量PCR法对单个样本进行检测

　　SLE患者221个样本和对照组分别196个样本，验证SNPMaP实验数据。

　　1.2.4.2 TaqMan探针和引物设计

　　TaqMan探针及相应引物由ABI Primer Express v2.0软件包（ABI PRISM）设计并由大连宝生物技术有限公司合成（表1）。表1 TaqMan探针及引物序列（略）

　　1.2.4.3 RealTime PCR法检测SNP位点

　　应用ABI Prism 7500HT荧光定量PCR仪结合Premix Ex Taq(Perfect Real Time) 试剂盒荧光探针技术进行检测，PCR扩增条件：94 ℃变性30 s后进入下列循环： 94 ℃ 15 s→58 ℃退火30 s→68 ℃ 30 s，共40个循环。实验结果由随机附带软件作出等位基因分布图后判断。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件进行分析，基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SNP芯片筛选DNA池SNP

　　250 K Sty I基因芯片系统中共检测238 304个SNP，其中235 268个SNPs的rs编号可以在HapMap CEPH Population（NCBI_Build35）中得到确认。
　　
　　根据正态分布，以location为横坐标，-logP为纵坐标，OR1为直径做气泡图，并剔除杂合度（Heterozygosity，Het）<0.1的SNP，其中-logP>1.5的SNP集中于染色体1，2，7，8，11，12，在第7号染色体上与SLE相关SNP的-logP分布情况见图1。

　　2.2 DNA池测序检测侯选SLE SNP

　　从SNPMaP分析结果中挑选Het>0.1且OR>1.5的6个SNP，用DNA池测序法验证，测序结果用Chroms软件查看（图2），估算等位基因频率的OR值（表2）。表2 DNA池测序法验证SNPMaP的PCR引物序列及OR值（略）

　　2.3 rs4731117 TaqMan荧光定量PCR法分析

　　2.3.1 rs4731117 TaqMan法检测结果见图3。

　　2.3.2 等位基因型统计

　　rs4731117在对照组和病例组中GG、GT、TT基因型频率及G和T等位基因频率比较有显著性差异（P<0.01），TT基因型及T等位基因的患病风险分别为2.66和2.21（表3）。表3 rs4731117基因多态性的分布（略）

　　3 讨论
　　
　　为了发现福建籍汉族人群中新的SLE易感SNP，本研究通过全基因组扫描法，采用SNP基因芯片与DNA池相结合（SNPMaP）的技术，高通量筛选SLE易感位点，并对筛选出的部分候选易感位点加以证实。由于DNA池和TaqMan实时定量检测结果与SNP基因芯片的结果具有良好的一致性，表明SNPMaP技术是一种高效、准确的基因筛查的工具。
　　
　　通过SNPMaP的技术对SLE易感位点进行筛选后，发现了108个新的SLE易感位点，并用DNA池测序法确定杂合度验证了其中的6个新的易感SNP位点（rs4669910、rs4731117、rs2101487、rs3019406、rs174534、rs12708994），结果与SNP基因芯片结果基本一致。利用TaqMan法对差异大的rs4731117位点进行单个样本验证，SLE病例组和正常对照组基因型和等位基因的分布差异均有统计学意义，证实rs4731117为一个新发现的易感位点。因此，认为应用SNPMaP筛选SNP和DNA池测序法来验证是可行的，其他5个SNP还有待进一步分析。
　　
　　新发现的SLE易感位点—rs4731117位于染色体7q31.32上，由于邻近的SNP位点经常存在连锁不平衡关系，因此又搜索了该位点附近与自身免疫性疾病相关的基因，发现了IRF5（IFN regulatory factor 5）基因，IRF5位于染色体7q32.1上，该基因与rs4731117距离5Mb。最近的研究显示IRF5是SLE的重要易感基因，与SLE高度相关［36］。目前，IRF5已发现了4个SLE易感SNP位点—rs2004640、rs2280714、rs10954213和rs2070197。Graham和Kozyrev等报道了其中两个功能性SNP，这两个SNP形成的单倍型与SLE相关［3］。其中一个SNP是rs2004640，位于内含子1中；另一个SNP是rs2280714，虽然它位于IRF5下游5 kb处，无明显影响转录结合位点，但它与IRF5表达水平有关，目前它的功能还无法解释。在SLE女性病人中rs2004640与疾病的强相关性也得到证实［7］。一些研究小组证实了IRF5的SNPrs10954213，它改变了IRF5多聚腺苷酸位点，因此与SLE患者IRF5水平增高机制有关［8］。
　　
　　DNA池是将大量患者DNA样本等量混合而成为一个混合样本，进行生物芯片SNP筛选和测序，以期发现SNP和疾病的易感基因。其最大的优势在于可以估计整体样本等位基因的频率，而不需要鉴定单个样本的基因型后再统计出等位基因的平均频率。DNA池主要的缺点在于无法得到单个样本的基因型和单倍型，一旦样本混合形成DNA池，就无法还原为单个样本，也不能分析等位基因与表型之间的差异。但评估的等位基因频率可与已知等位基因频率差异较大的候选SNP相对比，这些候选SNP可进一步通过单个基因型鉴定和传统的参数统计加以证实。

参考文献

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　　［3］Graham R R，Kozyrev S V，Baechler E C， et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus［J］. Nat Genet， 2006，38(5):550555.

　　［4］Sigurdsson S，Goring H H，Kristjansdottir G，et al. Comprehensive evaluation of the genetic variants of interferon regulatory factor 5 reveals a novel 5bp length polymorphism as strong risk factor for systemic lupus erythematosus［J］. Hum Mol Genet， 2008，17(6):872881.

　　［5］Reddy M V，VelazquezCruz R，Baca V，et al. Genetic association of IRF5 with SLE in Mexicans: higher frequency of the risk haplotype and its homozygozity than Europeans［J］. Hum Genet， 2007，121(6):721727.

　　［6］Sigurdsson S，Nordmark G，Goring H H，et al. Polymorphisms in the tyrosine kinase 2 and interferon regulatory factor 5 genes are associated with systemic lupus erythematosus［J］. Am J Hum Genet， 2005，76(3):528537.

　　［7］Demirci F Y，Manzi S，RamseyGoldman R，et al. Association of a common interferon regulatory factor 5 (IRF5) variant with increased risk of systemic lupus erythematosus (SLE)［J］. Ann Hum Genet， 2007，71(Pt 3):308311.

　　［8］Cunninghame Graham D S， Manku H， Wagner S，et al. Association of IRF5 in UK SLE families identifies a variant involved in polyadenylation［J］. Hum Mol Genet，2007，16(6):579591.