两种方法研究新型光敏剂五聚赖氨酸2羰基酞菁锌与牛血清白蛋白相互作用

　　　　 作者：李春艳， 阮冠宇， 单丽， 陈锦灿， 黄明东

【摘要】 　　目的 研究新型光敏剂五聚赖氨酸2羰基酞菁锌（ZnPc(Lys)5）与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用。方法 从BSA角度采用荧光光谱法和紫外可见光谱法通过荧光猝灭实验探讨ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的猝灭机制、结合常数及结合位点；从ZnPc(Lys)5角度采用胶束荧光增敏法测定ZnPc(Lys)5浓度通过Scatchard方程计算ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的结合常数和结合位点数。结果 荧光猝灭实验结果表明ZnPc(Lys)5对BSA的荧光有强烈的猝灭作用，猝灭机制主要是静态猝灭形成基态配合物。不同温度（298，303，308，313，318 K）的结合常数K1分别为12.1×104 L/mol，7.69×104 L/mol，6.12×104 L/mol，4.57×104 L/mol，3.76×104 L/mol，结合位点数分别为0.93，1.02，1.07，1.13，1.17。Scatchard方程计算出298 K结合常数K2为1.557×105 L/mol，结合位点数位1.07。结论 从两个方面计算的结合常数和结合位点数基本一致， ZnPc(Lys)5与血清白蛋白之间主要通过形成基态配合物的方式相互作用，进入血清白蛋白中1个结合位点。

【关键词】 光敏感药； 光谱法，荧光； 分光光度法，紫外线； 锌； 聚赖氨酸； 吲哚类； 血清白蛋白，牛

　　Interaction of Pentalysine βcarbonylphthalocyanine Zinc with Bovine Serum Albumin: Two Methods

　　LI Chunyan ， RUAN Guanyu， SHAN Li， CHEN Jincan， HUANG Mingdong

　　School of Pharmacy， Fujian Medical University， Fuzhou 350004， China;Department of pharmacy，Fujian Maternal and Child Health Hospital，Fuzhou， 350001， China;State Key Laboratory of Structural Chemistry， Fujian Institute of Structure of Matter，
Chinese Academy of Sciences， Fuzhou， 350002， China
　　
　　ABSTRACT: Objective To investigate the interaction of pentalysine βcarbonylphthalocyanine zinc (ZnPc(Lys)5) with bovine serum albumin (BSA) by two methods. Methods From the point of BSA， the quenching mechanism， binding constants and sites of the interaction between ZnPc(Lys)5 and BSA was investigated through the fluorescence quenching experiment by fluorescence spectrometry and UVvisible spectroscopy. From the point of ZnPc(Lys)5， the constants and sites of the interaction were calculated through micellar enhanced spectrofluorometric determination of ZnPc(Lys)5 concentration with Scatchard equation. Results The mechanism of fluorescence quenching is static quenching process. The binding constants and the number of binding sites were calculated at different temperatures (298， 303， 308， 313， 318 K): 12.1， 7.69， 6.12， 4.57， 3.76×104 L/mol and 0.93， 1.02， 1.07， 1.13， 1.17， respectively. The binding constant and the number of binding sites calculated from Scatchard equation at 298 K were 1.557×105 L/mol and 1.07， respectively. Conclusion The two methods produce approximately identical data of the binding constant and sites. The results indicate that ZnPc(Lys)5 strongly binds to BSA at a molar ratio of 1∶1.
　　
　　KEY WORDS: photosensitizing agents; spectrometry， fluorescence; spectrophotometry， ultraviolet; zinc; polylysine; indoles; serum albumin，bovine
　　
　　已有文献报道血清白蛋白在运输光敏剂酞菁过程中扮演着重要的角色，但其与血清白蛋白的相互作用的分子机制仍未彻底研究［1］。药物与血清白蛋白相互作用的研究方法有荧光分析法、紫外－可见光谱法、平衡透析法、圆二色谱法、超过滤法、傅立叶变换红外光谱法、核磁共振波谱及高效亲和色谱法等。国内外文献中大多采用荧光光谱法研究药物与白蛋白的相互作用，该法具有灵敏度高、选择性强、分析速度快、方法简单、操作方便、仪器价廉等优点［2］。本文采用荧光方法从两个不同的角度研究ZnPc(Lys)5与BSA相互作用：（1）从BSA角度通过荧光猝灭法应用著名的SternVolmer方程研究加入不同浓度ZnPc(Lys)5导致BSA中色氨酸（Trp）残基荧光猝灭，进而计算出表观猝灭常数并探讨了可能的猝灭机制和相互作用方式，然后通过双导数方程计算出ZnPc(Lys)5与BSA结合常数和结合位点；（2）从ZnPc(Lys)5角度通过胶束增敏荧光法分别测定结合态和游离态的ZnPc(Lys)5浓度，采用Scatchard方程计算ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的结合常数和结合位点数。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器和试剂

　　荧光光度计（Cary Eclipse，美国Varian公司）；多功能酶标仪（Synergy 4，美国BioTek公司）；ZnPc(Lys)5由中国科学院福建物质结构研究所黄明东课题组合成，纯度>99.5%；BSA（美国Amerosco公司进口分装）；SDS（美国Sigma公司）；考马斯亮蓝蛋白质浓度定量试剂盒（福建泰京公司）；其他试剂纯度均为分析纯以上；实验用水均为Millipore Q超纯去离子水（18.20 mΩ）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 荧光猝灭法

　　在离心管中分别加入终浓度2.5 μL/mol的脱脂BSA储备液，分别精确加入10 μL ZnPc(Lys)5系列标准溶液，用Tris缓冲液补足至500 μL，摇匀、静置10 min后，取200 μL加入96孔荧光板中，以290 nm作为激发波长，测定300～500 nm荧光发射光谱。

　　1.2.2 丙酮沉淀BSA和结合态ZnPc(Lys)5

　　ZnPc(Lys)5游离浓度：在离心管中加入2.5 μmol/L的脱脂BSA储备液，分别精确加入10 μL ZnPc(Lys)5系列标准溶液，用Tris缓冲液补足至500 μL，摇匀、静置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min离心5 min，分别取上清液800 μL，SDS储备液200 μL，用Tris缓冲液定容至5 mL，待测。
　　
　　ZnPc(Lys)5总浓度：在离心管中分别精确加入10 μL ZnPc(Lys)5系列标准溶液，用Tris缓冲液补足至500 μL，摇匀、静置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min离心5 min，分别取上清液800 μL，SDS储备液200 μL，用Tris缓冲液定容至5 mL，待测。
　　
　　空白对照组：在离心管中加入2.5 μmol/L的脱脂BSA储备液后，用Tris缓冲液补足到500 μL，振荡摇匀，静置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min离心5 min，分别取上清液800 μL，SDS储备液200 μL，用Tris缓冲液定容至5 mL，待测。

　　1.2.3 胶束荧光光谱测定ZnPc(Lys)5浓度

　　室温条件下用Cary Eclipse荧光光度计进行荧光光谱的扫描，10 mm石英比色皿进行测定。激发波长：610 nm，发射波长：692 nm；激发和发射狭缝均为5 nm，使用仪器自带滤光片；PTM电压：600 V，扫描速度：600 nm/min。
　　
　　ZnPc(Lys)5结合浓度=ZnPc(Lys)5总浓度-ZnPc(Lys)5游离浓度
　　
　　实际ZnPc(Lys)5游离浓度=ZnPc(Lys)5游离浓度-空白对照组

　　2 结果

　　2.1 ZnPc(Lys)5对BSA内源荧光的猝灭

　　固定BSA的浓度（2.5 μmol/L），改变ZnPc(Lys)5的浓度，在pH=7.4的Tris缓冲体系中测得不同浓度ZnPc(Lys)5时BSA的荧光光谱，结果见图1。
　　
　　2.2 ZnPc(Lys)5引起BSA内源荧光的猝灭机制

　　荧光猝灭过程通常可分为动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生相互碰撞而导致荧光物质的荧光量子产率下降的过程。静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发荧光或弱荧光的配合物，从而导致荧光物质荧光强度减小。其中动态猝灭遵循SternVolmer方程［2］：
　　
　　F0/F=1+Ksv［ZnPc(Lys)5］=1+Kqτ0［ZnPc(Lys)5］（1-1）

　　式（1-1）中，F0 为未加入ZnPc(Lys)5时荧光分子BSA的荧光强度，F 为加入ZnPc(Lys)5后BSA的荧光强度，［ZnPc(Lys)5］ 为ZnPc(Lys)5游离浓度，Kq为双分子猝灭过程的速率常数，τ0为无ZnPc(Lys)5存在下荧光分子的平均寿命，生物大分子的荧光寿命τ0约为108s，Ksv为SternVolmer猝灭常数，通过F0 /F对 ［ZnPc(Lys)5］作图，可由回归方程的斜率求出Ksv。
　　
　　按1.2.1项方法测定不同温度（298，303，308，313，318 K）下ZnPc(Lys)5对BSA作用后BSA荧光强度强度，其SternVolmer曲线结果见图2。由图2可知，ZnPc(Lys)5在4～50 μmol/L浓度范围中F0/F与 ［ZnPc(Lys)5］之间存在线性关系。通过式（1-1）计算得猝灭常数结果见表1。为了进一步确证上述结果，本文还观察了猝灭剂ZnPc(Lys)5的紫外可见光谱的变化情况，结果见图3。表1 不同温度下（298，303，308，313，318 K）荧光猝灭法计算的ZnPc(Lys)5与BSA相互作用结合参数和结合位点数（略），Tab 1 The binding parameters and sites for the interaction of ZnPc(Lys)5 and BSA by the fluorescence quenching method at five temperatures（298， 303， 308， 313， 318 K）（略）。

　　2.3 ZnPc(Lys)5与BSA结合常数和结合位点数的计算

　　对于静态猝灭，假设生物大分子有n个相互独立的结合位点，并且位点之间不存在相互作用［3］，则：
　　
　　n(ZnPc(Lys)5+BSA→（ZnPc(Lys)5）nBSA(1-2)
　　
　　(ZnPc(Lys)5)nBSA为生成的配合物，则其结合常数Ks为：
　　
　　Ks=［(ZnPc(Lys)5)nBSA］+［ZnPc(Lys)5)］n［BSA］(1-3)
　　
　　［BSA］为体系中BSA游离浓度，设［BSAt］为BSA的总浓度则［BSAt］＝［(ZnPc(Lys)5)nBSA］+［BSA］代入式（13）可得
　　
　　Ks=(［BSAt］-［BSA］)/［ZnPc(Lys)5)］n［BSA］(1-4)
　　
　　在一定的波长范围内，若体系的荧光仅由BSA所产生，即猝灭剂和配合物不发荧光，则有
　　
　　F0/F=［BSAt］/［BSA］(1-5)
　　
　　式中，F0和F分别表示未加入ZnPc(Lys)5和加入ZnPc(Lys)5后BSA的荧光强度。将式（1-5）代入（1-4）经变化后得：

　　
　　lg(F0-F)/F=lgK1+nlg［ZnPc(Lys)5］(1-6)　　

　　当ZnPc(Lys)5总浓度大大于BSA浓度时，ZnPc(Lys)5总浓度可近似看作其游离浓度代入式（1-6）计算。通过lg(F0-F)/F对lg［ZnPc(Lys)5］作回归曲线，结果见图4，由斜率和截距求出ZnPc(Lys)5与BSA结合常数K1及结合位点数n，结果见表1。

　　2.4 Scatchard方程计算ZnPc(Lys)5与BSA结合常数和结合位点数
　　
　　药物与蛋白质分子间的相互作用采用位点结合模型解释，即
　　
　　r=nK1［ZnPc(Lys)5］/(1+K2ZnPc(Lys)5］)（1-7）
　　
　　式（1-7）中，［ZnPc(Lys)5为溶液中ZnPc(Lys)5的游离浓度，r为平均每摩尔BSA分子结合ZnPc(Lys)5的物质量，K2为结合常数，n为结合位点数，即一个BSA分子能结合的ZnPc(Lys)5数目。
　　
　　式（1-7）可变换成著名的Scatchard方程：
　　
　　r［ZnPc(Lys)5］=nK2-rK2（1-8）
　　
　　按“1.2.2”项方法计算ZnPc(Lys)5结合浓度和游离浓度，根据方程（1-8）通过r/［ZnPc(Lys)5］对r作线性回归，求得结合常数K2为1.557 × 105 L/mol，结合位点数位为1.07（r= 0.9963）。

　　3 讨论
　　
　　ZnPc(Lys)5［4］（图5）是通过β单取代羧基酞菁锌（βZnPc）［5］与水溶性聚赖氨酸多肽连接得到的一种新型两亲性酞菁锌。侧链上聚赖氨酸富含阳离子，对具有比正常细胞表面更多负电荷的肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用［6］，增加酞菁在肿瘤组织的富集，降低活性光敏剂在正常组织的富集，从而提高靶向性。因此，ZnPc(Lys)5有望成为一种理想的抗癌光敏剂，进行ZnPc(Lys)5与白蛋白相互作用研究具有重要意义。
　　
　　由于血清白蛋白中存在色氨酸和酪氨酸，使其具有内源荧光。以280 nm为激发波长时，主要激发白蛋白中色氨酸和酪氨酸残基的荧光，本文选择激发波长为290 nm， BSA发射的内源性荧光则来源于色氨酸。由图1可见，ZnPc(Lys)5对BSA内源荧光产生强烈猝灭作用，当浓度达50 μmol/L时，BSA荧光强度仅约为未加入ZnPc(Lys)5时BSA荧光强度的35%，但最大发射波长没有明显位移。表明ZnPc(Lys)5使得BSA中色氨酸残基的荧光量子产率大幅下降，但对色氨酸所处的内环境极性没有明显影响。
　　
　　目前认为动态与静态猝灭可以依据猝灭常数随温度的变化来区别。对于动态猝灭，温度升高，将增加有效碰撞的粒子数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随着温度的升高而增大；若是静态猝灭，温度升高将降低复合物的稳定性，使结合常数减小。此外，还可以通过观察荧光分子的吸收光谱的变化情况来区别二者。动态猝灭主要影响荧光分子的激发态，一般不改变荧光分子的吸收光谱；而静态猝灭是基态猝灭剂与荧光分子形成配合物的结果，通常荧光分子或猝灭剂吸收光谱会有所变化［2］。由表1可以看出，随着温度的升高，猝灭常数减小，表明ZnPc(Lys)5与对BSA的荧光猝灭可能主要是静态猝灭。另外，假设ZnPc(Lys)5与BSA猝灭方式为动态猝灭，根据式（1-1）计算得不同温度下的猝灭速率常数Kq数量级在1012～1013 L·mol-1·s-1，这些数值都远大于生物分子的最大碰撞扩散猝灭速率常数2.0×1010 L· mol-1·s-1［7］，也表明ZnPc(Lys)5对BSA的荧光猝灭可能是静态猝灭。为进一步区分两种猝灭机制，图3的ZnPc(Lys)5的紫外可见光谱的变化情况在没有BSA存在下ZnPc(Lys)5在633 nm有聚集态的吸收峰，几乎没有673 nm的单体吸收峰［8］。在体系中逐渐加入BSA 后，峰形发生变化，在673 nm出现单体的吸收峰并伴随着BSA浓度的增大而增强，在633 nm的聚集态特征吸收峰却随着BSA浓度的增大反而减弱，表明ZnPc(Lys)5与BSA之间存在相互作用形成基态配合物［9］，从而导致ZnPc(Lys)5解聚，进一步验证了ZnPc(Lys)5引起BSA的荧光猝灭的机制主要是静态猝灭，而不是动态猝灭。
　　
　　从测定BSA荧光强度角度，当ZnPc(Lys)5与BSA以形成基态配合物方式相互作用时，可以通过双导数方法计算二者结合常数。由图4看出，每一温度下双导数图同样都得到线性关系良好的回归曲线（R>0.99）。由表1看出，通过双导数和SternVolmer两种方程得到的结合常数比较接近，均在同一数量级，各温度平均结合位点数n为1.1，表明ZnPc(Lys)5与BSA有一个结合位点。从测定ZnPc(Lys)5荧光强度角度，采用Scatchard方程计算的298 K下ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的结合常数和结合位点数与同温度下双导数和SternVolmer两种方程得到的结合常数和结合位点数基本一致。采用Scatchard方程计算结合常数和结合位点数需要测定药物的游离浓度，由于药物的游离浓度通常较难测定，所以国内文献大多采用双导数和SternVolmer两种方程计算结合常数和结合位点数。国外文献中有采用Scatchard方程计算结合常数和结合位点数的报道，但文中对于药物游离浓度的测定方法没有明确指出，丹麦学者van de Weert最近专门发文指出这个缺陷［10］。本文明确阐述了测定BSA中ZnPc(Lys)5游离浓度的方法。
　　
　　到底ZnPc(Lys)5作用在BSA的哪一位点上，可以通过建立分子模型来预测，进一步用竞争络合法确认［3］。

参考文献

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　　［10］van de Weert M. Fluorescence quenching to study proteinligand binding: Common Errors［J］. Journal of Fluorescence， 2009， 12: 15.