半胱氨酰白三烯受体在大鼠分泌性中耳炎黏膜中的表达

【摘要】 　　目的 探讨半胱氨酰白三烯受体（CysLTR）1、2在变应性分泌性中耳炎黏膜中表达及其变化。 方法 建立卵白蛋白激发变态反应中耳炎大鼠模型。实验动物分为阴性对照组Ⅰ、阴性对照组Ⅱ和实验组，采用半定量反转录聚合酶链反应（RTPCR）技术分别检测半胱氨酰白三烯受体CysLTR1、CysLTR2 mRNA在中耳黏膜的表达变化。 结果 CysLTR 1、CysLTR 2 mRNA在阴性对照组Ⅰ、Ⅱ的中耳黏膜表达很低，炎症情况下两型受体在实验组中耳黏膜的表达均显著增高，相对值分别为（0.42±0.05）和（0.28±0.06），与阴性对照组Ⅰ、Ⅱ比较差别有统计学意义（P<0.01）。 结论 CysLTR 1、CysLTR 2均在中耳黏膜表达，变应性炎症时表达明显上调。

【关键词】 中耳炎，伴渗出液； 半胱氨酰； 白三烯类； 受体，白三烯； 白三烯拮抗剂； 聚和酶链反应
　　
　　ABSTRACT: Objective To determine the expressions of cysteinyl leukotriene receptors， CysLTR1 and CysLTR2， in a rat model of otitis media with effusion induced by ovalbumin(OVA). Methods Eighteen SpragueDawley rats were pided into three groups (the experimental group， negative control Ⅰ and Ⅱ). Rats from the experimental group were sensitized to OVA via intraperitoneal injection once a week for two weeks and then challenged transbullarly. Middle ear mucosas were harvested and assayed for CysLTR1 and CysLTR2 mRNA expressions by semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction. Results The mRNA expression of CysLTR1 and CysLTR2 was detectable in middle ear mucosas of the negative control groups and significant upregulation was observed after OVA challenge (P<0.01). Conclusion Two types of receptors of cysteinyl leukotriene are present in the middle ear mucosa and can be modulated immunologically.
　　
　　KEY WORDS: otitis media with effusion； cysteine； leukotrienes； receptors，leukotriene； leukotriene antagonists； polymerase chain reaction

　　分泌性中耳炎是严重影响儿童健康的常见病，其致病机理复杂，目前研究认为变态反应是一重要的致病因素或促发因素［1］。在变态反应炎症中，半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes， CysLTs）是一重要的致炎介质，其在中耳炎发病中的作用，已有相关研究报道［2］。CysLTs可分为CysLTC4、CysLTD4、CysLTE4，必需通过和相应的受体结合才能发挥其病理生理效应。因此，有必要对白三烯受体在中耳黏膜表达情况进行研究。本研究拟通过建立变态反应分泌性中耳炎动物模型，探讨二型半胱氨酰白三烯受体（cysteinyl leukotriene receptors，CysLTR）1，2在变应性分泌性中耳炎黏膜中表达变化及其调节机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物和分组

　　采用耳廓反射灵敏、健康清洁级SD大鼠18只，雄性，体质量约200 g（由福建医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK闽20040002）。应用随机数字表法将动物均分成3组，分别为阴性对照组Ⅰ、阴性对照组Ⅱ和实验组。

　　1.2 动物模型的建立

　　实验前所有动物均经耳显微镜检查排除中耳感染。参照文献［1］方法建立变态反应中耳炎动物模型：实验组腹腔注射0.8 mL溶有10 mg卵清蛋白（ovalbumin，OVA，sigmaⅤ级）+5.14 mg氢氧化铝凝胶佐剂的PBS磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4），每周1次，连续2周，此为全身致敏阶段；2周后予盐酸氯胺酮（100 mg/mL）+地西泮（5 mg/mL）2∶1混合液（3 mL/kg）腹腔注射深度麻醉，仰卧位，在手术显微镜下相当于舌骨水平做一切口，分离舌骨肩胛肌及舌骨胸骨肌，暴露耳泡底壁，无菌技术将含OVA 2 mg的50 μL PBS液注入听泡，此为耳内激发阶段。阴性对照组Ⅰ耳内激发时用PBS液代替OVA/PBS混合液，阴性对照组Ⅱ全身致敏步骤用PBS液取代OVA/PBS混合液，余同实验组。激发前均肌注青霉素预防细菌感染。

　　1.3 方法

　　1.3.1 一般观察及组织学检查

　　末次激发后48 h，麻醉后先在电耳镜下观察双耳鼓膜情况，后断头迅速取下双侧听泡。解剖显微镜下观察鼓室内黏膜和积液情况；右侧听泡切取部分按常规方法固定、脱钙、包埋，作组织学切片分析。

　　1.3.2 RNA提取及RTPCR实验

　　1.3.2.1 组织总RNA提取

　　各组每只大鼠左侧听泡予DEPC水冲洗2次，洗净弃去。采用异硫氰酸胍裂解法提取左侧听泡鼓室黏膜组织总RNA［34］，即将35 μL异硫氰酸胍注入鼓室，轻轻震摇15 s，吸出置于EP管，重复3次，再加入1.0 mL Trizol吹打混匀，置室温5 min，加入氯仿200 μL，激烈震荡15 s，置于室温2～3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，将上清水相（约1 mL）移入新的EP管，加入异丙醇0.5 mL，静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，倾倒弃上清，加1 mL 75%乙醇清洗EP管，吹打混匀，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，弃上清，晾干，加50 μL DEPC水溶解。分光光度计测量260 nm和280 nm的比值判断RNA纯度和浓度。

　　1.3.2.2 引物设计及合成

　　由上海博亚生物工程公司合成。RTPCR引物根据GenBank中CysltR1基因（基因号：NM_053641）、CysltR2基因（基因号：NM_133413）、GAPDH（基因号：X02231）用DNAMAN 4.0程序设计如下：

　　CysltR1基因引物序列
　　
　　上游:5’TGTGGGTTTCTTTGGCAATAG
　　
　　下游:5’GTTTGTTTGTCCTGTGGAGGC

　　CysltR2基因引物序列
　　
　　上游5’CCTATTCATAAGCACCCTGCC
　　
　　下游5’CCAAGTGGATGGTCCGAAGT

　　GAPDH基因引物序列
　　
　　上游5’GCTGGTGCTGAGTATGTCGT
　　
　　下游5’GAATGGGAGTTGCTGTTGAA

　　1.3.2.3 RTPCR按照Invitrogen公司一步法RTPCR试剂盒（SuperScript OneStep RTPCR with Platinum Taq kit）说明书，在冰上依次加入12.5 μL 2×buffer，2.0 μL总RNA，0.5 μL正向引物， 0.5 μL反向引物，0.5 μL ssRT/Taq 酶混合物，9.0 μL DEPC水，总体积为25 μL。在PE2400 DNA扩增仪上进行RTPCR: 50 ℃ 30 min合成cDNA，94 ℃ 2 min预变性并活化Platinum Taq，之后按94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，进行36个循环的扩增，最后72 ℃延伸7 min。RTPCR产物用1.0% Agrose电泳分离鉴定。

　　1.3.2.4 半定量分析

　　电泳结果经GeneSnap（SynGene， Version 5.00.09）成像后用GeneTools（SynGene， Version 3.00.22）进行半定量分析。以曲线下峰面积作为PCR产物含量，用目的基因与同一标本内参照基因（GAPDH）积分值之比，表示该基因mRNA相对表达水平。

　　1.4 统计学处理

　　数据以x±s表示，采用SPSS 10.0单因素方差分析统计方法，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 耳窥镜及组织学检查

　　2组阴性对照组所有大鼠鼓膜色泽基本正常，标志清楚，鼓室黏膜基本正常；实验组鼓膜内陷、混浊，有不同程度充血。解剖显微镜下观察可见，实验组大鼠鼓室黏膜水肿明显，可见少量淡黄色积液。组织学切片显示，实验组与阴性对照组比较可见鼓室黏膜明显增厚，黏膜下有较多炎症细胞浸润（图1）。

　　2.2 RTPCR结果

　　将提取的总RNA在紫外分光光度仪下测其吸光度（A）值，各样品的OD260/OD280均>1.7，表明提取的RNA纯度符合要求，1％琼脂糖凝胶电泳可见明显的18S和28S两条带，表明RNA完整性好。预期的目的基因CysLTR1、CysLTR2片段长度分别为440 bp和560 bp，从实验组和阴性对照组Ⅰ、ⅡCysLTR1、CysLTR2 mRNA扩增结果可见，两型受体在阴性对照组Ⅰ、Ⅱ中耳黏膜均有较弱表达，实验组表达明显增强（图2）。阴性对照组Ⅰ、阴性对照组Ⅱ和实验组CysLTR1、CysLTR2 mRNA相对值比较，差别有统计学意义（P<0.01，表1）。表1 3组CysLTR1、CysLTR2 PCR产物光密度相对值（略）Tab 1 The optical density relative magnitude of CysLTR1， CysLTR2 PCR products in 3 model groups（略）。

　　3 讨论
　　
　　Ⅰ型变态反应可分为早发相反应和迟发相反应，后者的病理变化主要包括炎症细胞侵润、组织水肿、杯状细胞增生、黏液分泌以及组织细胞的坏死。Hardy认为，以往很多学者只注重研究以组胺介导为主的Ⅰ型变态反应速发相在分泌性中耳炎致病中的作用，实际上，Ⅰ型变态反应迟发相对慢性分泌性中耳炎的发病更为重要，并通过动物实验证实［1］。认识到迟发相反应在分泌性中耳炎致病机制中的作用，将对某些与变态反应有关的分泌性中耳炎的防治产生重要影响。抗组胺制剂主要对速发相起作用，对迟发相的治疗效果不好，这与临床观察到的抗组胺制剂无益于分泌性中耳炎治疗的循证医学相一致［5］。而白三烯受体拮抗剂却可同时对早发相、迟发相起作用，已应用于支气管哮喘、变态反应性鼻炎的治疗，有较好疗效［6］。一些学者也进行了有关白三烯受体拮抗剂应用于分泌性中耳炎的基础和临床研究。Tada等的研究显示，白三烯受体拮抗剂普鲁司特能够完全预防LTD4诱导的实验性分泌性中耳炎的发生［2］。笔者的前期试验研究表明，白三烯受体拮抗剂孟鲁司特可抑制大鼠中耳炎症黏膜组织黏蛋白的表达，从而减轻中耳炎症反应［7］。Combs等于2004年首次尝试性地将另一受体拮抗剂孟鲁司特应用于治疗一组持续性中耳积液的患儿，中耳积液的清除率治疗组和对照组分别为58%和16%，具有显著效果。其作用机制主要是白三烯受体拮抗剂通过与CysLTs竞争性结合相应的受体发挥拮抗作用［8］。由于CysLTs及其受体拮抗剂都要通过白三烯受体起作用，因此有必要对白三烯受体在中耳组织中的表达以及在炎症刺激下的表达变化进行研究。
　　
　　已知的白三烯受体有二型，即CysLTR1和CysLTR2。目前，对CysLTR1的生理功能了解得比较清楚，其配体是CysLTs，主要包括CysLTC4和CysLTD4，后者通过与CysLTR1结合发挥一系列病理生理功能。其与中耳炎发病的关系主要有增加毛细血管的通透性，促进腺体黏液的分泌，抑制咽鼓管黏纤系统的功能等［910］。目前研制的白三烯受体拮抗剂仅能与CysLTR1特异结合发挥相应药理作用。由于尚未发现能与CysLTR2特异结合的拮抗剂，对其功能了解甚少，通过基因敲除技术间接提示CysLTR2可能在增加血管通透性和炎性纤维化方面起作用。本实验通过建立变态反应大鼠动物模型，采用RTPCR技术研究了CysLTR1、CysLTR2 mRNA在中耳黏膜中的表达及受调节情况。结果显示，CysLTR1、CysLTR2 mRNA在阴性对照组中耳黏膜表达较弱，炎症刺激可使其表达显著上调。Zhang等研究二型CysLTR mRNA在小鼠哮喘模型气管黏膜的表达及其变化，结果也显示CysLTR1 mRNA在炎症情下表达上调，与本实验在中耳黏膜观察到的情况一致［11］。但CysLTR2 mRNA的表达情况与本实验不同，这可能与不同来源组织受体表达的调节模式不同有关。中耳炎症导致CysLTR mRNA表达上调的原因可能与炎症环境中细胞因子的作用有关。Thivierge等通过体外实验证明，Th3型细胞因子IL4、IL5、IL13可促进炎性细胞（嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等）CysLTR1高表达，表达上调的具体机制尚不清楚，可能是在转录水平激活了CysLTR1基因的表达，也可能涉及转录后蛋白的翻译，相反的，Th1细胞因子IFNr则不具有这种作用［1213］。据此可以推测，与变应性中耳炎有关的Th3细胞因子通过某些信号通路，在促进炎症细胞中耳黏膜浸润的同时，也促进局部炎症细胞CysLTR1的表达，最终增强了CysLTs介导的病理生理效应。白三烯受体拮抗剂则可通过与CysLTs竞争性结合受体在这一环节发挥其拮抗作用，减轻相应的炎症症状。正如前述，通过基因敲除技术间接提示CysLTR2除了增加血管通透性外，可能在炎性纤维化方面起作用，提示CysLTs还可能通过与CysLTR2结合，与慢性分泌性中耳炎晚期引起的鼓室粘连纤维化病理机制有关，随着研发出针对CysLTR2的拮抗剂，将有助于这方面的深入研究。
　　
　　组织学上中耳黏膜与上呼吸道黏膜相延续，可以理解上呼吸道衍化而来的中耳黏纤系统同样具有呼吸道黏膜的固有特性，上下气道反应一致性概念已延伸到中耳领域，变态反应同样可以在中耳黏膜发生。白三烯受体拮抗剂已有效应用于变应性鼻炎、哮喘的治疗，其在分泌性中耳炎的治疗近来也受到重视。最近的一项研究显示，应用白三烯受体拮抗剂治疗一组合并哮喘的分泌性中耳炎患者，哮喘缓解的同时中耳炎症状也相应得到改善［14］。本研究为其应用于某些可能和变态反应有关的分泌性中耳炎的治疗提供理论基础。

参考文献

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