矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究

　　　　 作者：袁芳，李厚轩，金峰，郑瑜谦，闫福华

【摘要】 　　目的 观察矿化诱导培养能否促进冻存骨髓基质细胞（BMSCs）在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原，为牙周组织工程中选择适宜的种子细胞的保存和培养条件提供参考。 方法 体外分离培养Beagle犬BMSCs，经冻存12个月后，在矿化诱导培养液（矿化诱导组）或基础培养液（非矿化诱导组）中形成BMSCs胶原膜支架复合物，将矿化诱导培养液处理的单纯胶原膜支架(空白对照组)、2种BMSCs胶原膜复合物分别植入裸鼠背部皮下组织中，术后第4周行组织病理学和免疫组织化学观察，分析各组标本中的Ⅰ型胶原形成量。 结果 空白对照组植入胶原膜后，新生胶原分布很少；非矿化诱导组胶原分布明显增多；矿化诱导组中见大量新生的胶原形成。免疫组织化学光密度测量显示，矿化诱导组(0.1963±0.0126)>非矿化诱导组(0.1489±0.0037)>空白对照组(0.0775±0.0058)（P<0.05）。 结论 矿化诱导培养能够促进冻存的BMSCs在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原。

【关键词】 低温保存； 骨髓细胞； Ⅰ型胶原； 牙周组织； 组织免疫组织化学
　　
　　ABSTRACT: Objective To explore the effects of osteoinductive culture on the synthesis of type Ⅰ collagen by bone marrow stromal cells (BMSCs) in nude mice. Methods BMSCs from beagle dogs were harvested and cryopreserved for 12 months. Recovered BMSCs were combined with collagen scaffold in vitro in osteoinductive or nonosteoinductive culture medium. Osteoinductive conditioned collagen scaffold alone， osteoinduced and noninduced BMSCsscaffold complex were respectively implanted into the subcutaneous tissues of nude mice for 4 weeks. Type Ⅰ collagen formation was evaluated by H&E staining and immunohistochemistry(IHC). Results Scarce collagen fibers were observed in the group implanted with collagen scaffold alone， moderate collagen fibers in noninduced BMSCsscaffold group， and large quantities of newly formed collagen fibers in osteoinduced BMSCsscaffold group. Enhanced formation of type Ⅰ collagen was observed in osteoinduced BMSCsscaffold group (0.1963±0.0126)， with lesser formation in noninduced BMSCsscaffold group (0.1489±0.0037) and scaffold alone group(0.0775±0.0058)（P<0.05）. Conclusion Osteoinductive culture can enhance type Ⅰ collagen formation in nude mice by cryopreserved BMSCs.
　　
　　KEY WORDS: cryopreservation； bone marrow cells； collagen type Ⅰ； periodontium； immunohistochemistry； disease models，animal
　　
　　骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一种能分化为成纤维细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种类型细胞的多能干细胞，在骨组织、软骨组织以及牙周组织缺损的再生医学中有着广泛的应用前景［1］。本课题组前期研究发现，冻存BMSCs复苏传代后，在体外培养条件下仍保持了较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力，并且具有未冻存细胞相似的体内促进牙周组织再生的能力［23］。寻找适宜的细胞培养条件对于牙周再生医学有着重要意义。因此，本实验拟研究矿化诱导培养能否促进冻存后的BMSCs在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原，从而为选择适宜培养条件、提高BMSCs体内再生牙周组织的能力提供参考。

　　1 材料和方法
　　
　　1.1 实验动物及主要试剂

　　健康成年Beagle雌性犬（体质量11 kg)、BALB/c裸鼠42只(4～6周，体质量18～23 g)；新生牛血清(江滨生物，杭州)；DMEM(Gibco，美国)；地塞米松、维生素C和β甘油磷酸钠(Sigma，美国)；BME10X医用胶原膜 (北京中国医学科学院生物医学工程研究所)；Ⅰ型胶原抗体、SABC过氧化物酶试剂盒(博士德生物，武汉)；DAB显色试剂盒、EDTA抗原修复液(福州迈新生物技术开发有限公司)。

　　1.2 方法
　
　　1.2.1 BMSCs的分离与冻存

　　采用实验室所用的“改良全骨髓培养法”获取细胞［4］，培养传至第2代；将2.5×106 mL-1 BMSCs以10%二甲基亚砜、10%新生牛血清、80% DMEM为冻存培养液，按4 ℃ 0.5 h、-20 ℃ 0.5 h和-80 ℃冰箱过夜后放入液氮中，低温保存12个月。

　　1.2.2 BMSCs的复苏与培养

　　冻存的BMSCs在37 ℃恒温水浴中迅速翻转解冻，离心、弃冻存液，收集细胞于标准环境中培养备用。以含10%的新生牛血清的DMEM为基础培养液，以含10%新生牛血清、10-8 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C和10 mmol/L β甘油磷酸钠的DMEM为矿化诱导培养液，复苏细胞在基础培养液和矿化诱导液中分别与支架在体外复合。

　　1.2.3 BMSCs胶原膜的复合

　　将0.5 cm×0.5 cm的胶原膜在24孔板内分别加入基础培养液与诱导培养液预湿；取复苏的BMSCs，以终浓度为1×107 L-1接种于已预湿的胶原膜上，每片接种30 μL，暂不加培养液，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养0.5 h；然后分别加入基础培养液与诱导培养液2 mL继续培养，隔日换液，倒置显微镜下观察细胞附着情况。

　　1.2.4 BMSCs胶原膜复合物的植入

　　BMSCs胶原膜支架体外复合培养5 d后，将裸鼠用100 mg/kg氯胺酮麻醉后，于背部作前后向约0.6 cm的切口，切开皮肤及皮下组织，在裸鼠皮下分别植入相应复合物。分组情况为：（1）矿化诱导组（15只）：植入在矿化诱导培养液中复合的BMSCs胶原膜复合物；（2）未矿化诱导组（15只）： 植入基础培养液中复合的BMSCs胶原膜复合物；（3）对照组（12只）：植入矿化诱导培养液中预湿的胶原膜支架。

　　1.2.5 取材及组织学观察

　　术后4周将各组动物引颈致死，取出植入物及周围组织，在4%的多聚甲醛中固定，10%EDTA脱钙液中脱钙，石蜡包埋，制成5 μm连续性切片，苏木精伊红染色，光学显微镜下观察新生组织。

　　1.2.6 免疫组织化学染色及测量

　　按SABC过氧化物酶试剂盒说明书进行。切片脱脂至水洗，PBS冲洗后置于50 μL过氧化酶阻断溶液中室温下孵育10 min，用以阻断内源性过氧化物酶的活性。抗原修复后先后滴加第一抗体和二抗，PBS冲洗。滴加SABC试剂，28 ℃孵育20 min，加DAB显色剂，在显微镜下观察，胶原显色为棕黄色。以0.01 mol/L PBS代替第一抗体作阴性对照。利用Imageproplus 6.0图像分析软件对染色强弱进行光密度测定，每张切片随机选取4个高倍视野，与阴性对照做对比，测量每个标本的光密度值。

　　1.3 统计学处理

　　将光密度测量的数据行单因素方差分析（one way ANOVA），判断组间是否存在差别；如存在差别时，采用LSD法进行2组之间的比较。P<0.05为差别有统计学意义。福建医科大学学报 2010年8月 第44卷第4期袁 芳等：矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究

　　2 结果

　　2.1 大体观察

　　所有裸鼠术后活动正常，植入处表面皮肤完整、光滑，无炎症反应，植入物无脱出，无免疫排斥反应。取出的细胞材料复合体标本质地较对照组标本硬。

　　2.2 光镜观察

　　植入第4周镜下观察可见，对照组胶原膜边界清晰，胶原膜边缘及内部，基本没有细胞生长(图1A)；未矿化诱导组胶原膜两侧及中间皆有细胞生长，其一侧胶原纤维分解较多，并有细小的条索状新生胶原形成(图1B)。矿化诱导组胶原膜两侧皆有细胞生长，其中一侧细胞生长较多，并进入胶原膜中，胶原膜条索状的胶原纤维变薄，并有断裂，同时伴有细小的条索状新生胶原组织(图1C)。

　　2.3 免疫组织化学染色及测量

　　对照组中，胶原膜表面可以看到Ｉ型胶原的表达，胶原膜内部未见Ⅰ型胶原表达(图2A)。未矿化诱导组Ｉ型胶原呈树突状长入胶原膜内部，其表达集中于胶原膜表面，以及胶原膜内部约三分之一厚度部位(图2B)。矿化诱导组胶原膜内部Ｉ型胶原大量表达，范围较广泛（图2C）。免疫组织化学染色标本的光密度测量显示，矿化诱导组(0.196 3±0.012 6)>非矿化诱导组(0.148 9±0.003 7)>空白对照组(0.077 5±0.005 8)，组间比较差别有统计学意义（P<0.05）。

　　3 讨论
　　
　　慢性牙周炎是一种慢性感染性疾病，可以导致牙周膜、牙槽骨等牙齿支持组织的丧失。干细胞移植是修复慢性牙周炎造成的牙周组织丧失的良好方法，BMSCs具有来源方便，取材简单，对患者造成损伤小等优点，是目前最有希望在牙周再生医学中广泛使用的种子细胞。
　　
　　Ⅰ型胶原是骨组织中最主要的胶原，占骨组织有机成分的80%～90%，构成了骨基质中的蛋白框架，它的合成与分泌是骨组织形成的前提条件；Ⅰ型胶原的有序排列是形成骨组织机械力量的主要因素［5］。本实验选择的BMSCs是一种多能干细胞，在植入裸鼠体内可能分化为成纤维细胞、成骨细胞等，合成和分泌Ⅰ型胶原；通过对比2种培养液对BMSCs的体内生物学活性，发现矿化诱导培养液比非矿化诱导培养更有利于Ⅰ型胶原在裸鼠体内合成，这种促进Ⅰ型胶原合成的能力能否在牙周组织局部发挥作用尚需进一步通过动物实验得以证实。
　　
　　组织工程中支架的选择也会影响种子细胞的分化和再生能力。本实验选取牙周组织再生中常用的胶原膜作为支架，前期实验已证实BMSCs能够在BME10X胶原膜支架材料上良好附着和生长，BME10X胶原膜支架可以应用于牙周组织中［6］。本实验发现，细胞支架材料复合物移植到裸鼠体内4周后，BMSCs以支架材料支架为基础，分泌大量的细胞外基质，形成新生的Ⅰ型胶原，而胶原膜支架大部分降解吸收，而单纯支架材料移植到裸鼠形成体内，支架材料很少分解，未见Ⅰ型胶原表达。实验中发现，胶原膜两侧支架的分解程度、细胞的生长数量以及Ⅰ型胶原表达大多呈现不对称性，这是由于在体外细胞复合胶原膜培养的时候，只是在胶原膜的一侧种植BMSCs，导致细胞支架材料复合物两侧细胞数量不对称所致，提示利用组织工程方法进行骨修复重建时，组织细胞在支架材料上应尽可能的多维附着生长。
　　
　　本研究采用长期冻存的冻存BMSCs作为种子细胞，前期实验已证实适宜的冻存条件不会影响其体外增殖分化能力，形成骨组织的能力，而且也没有影响其修复牙周组织缺损的能力，本实验进一步证实矿化诱导液能够促进BMSCs在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原，在进一步的实验中尚需证实矿化诱导培养液能否促进BMSCs的体内修复牙周组织缺损的能力。

参考文献

　　［1］Bueno E M，Glowacki J. Cellfree and cellbased approaches for bone regeneration［J］. Nat Rev Rheumatol， 2009，5(12):685697.

　　［2］袁芳，闫福华，李厚轩，等. 冻存骨髓基质细胞体外成骨潜能的实验研究［J］. 福建医科大学学报， 2006，40(4):311314.

　　［3］Li H，Yan F，Lei L，et al. Application of autologous cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cells for periodontal regeneration in dogs［J］. Cells Tissues Organs， 2009，190(2):94101.

　　［4］闫福华，陈欣戬，詹璇，等. 不同浓度自体骨髓基质细胞移植修复Beagle犬Ⅱ°根分叉病变的研究［J］. 组织工程与重建外科杂志， 2005，1(6):312315.

　　［5］Viguet C S，Garnero P，Delmas P D. The role of collagen in bone strength［J］. Osteoporosis International， 2006，17(3):319336.

　　［6］闫福华，刘崇武，周广东，等. 骨髓基质细胞在三种可吸收生物膜上附着及增殖的比较［J］. 福建医科大学学报， 2002，36(1):1012.