脆性X智力低下蛋白结构及功能的研究进展

【关键词】 脆性X综合征；基因；RNA结合蛋白质类；树突

　　脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS）是一种发病率仅次于唐氏综合征的遗传性智力低下疾病，其发病率在男性为1/4 000，女性为1/8 000。临床主要表现为：程度不等的智力低下、巨睾丸、特殊面容、语言发育障碍以及行为异常（如注意力集中时间短、拍手、目光接触回避）等。脆性X智力低下1基因（fragile X mental retardation 1 gene，FMR1）位于染色体Xq27.3，由17个外显子和16个内含子组成，横跨38 kb。其5'末端非编码区有一CGG三核苷酸重复序列，在其上游250 bp左右有一CpG岛，其甲基化可导致脆性X综合征。根据CGG三核苷酸重复数，可以把FMR1基因分为四种类型：正常型（normal type，n<50），中间型（intermediate type，50

　　1 脆性X智力低下蛋白的结构
　　
　　FMR1基因编码的脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardion protein，FMRP）蛋白主要位于细胞质，少量见于细胞核，分布于哺乳动物的脑、睾丸、脾、血液、肝等组织，由632个氨基酸残基组成，分子量约为69～70 kDa。其氨基酸序列可以分为三个部分：N末端（1～204），2个KH结构域（205～422），C末端（516～632）（图1），其中N末端（Nterminal domain of FMRP，NDF）是一高度保守的氨基酸序列，而高度可变的C末端则含有一RGG框（精氨酸甘氨酸簇），2个KH结构域（核蛋白K同源结构域）即KH1与Kh3结构域分别由外显子7和外显子8、9编码，而RGG框则由外显子15、16编码。FMRP还有一个核定位信号（NLS）和一个核输出信号（NES），分别位于FMRP的第115150氨基酸残基内和FMR1基因第14外显子编码的氨基酸序列内。FMRP含有四个RNA结合区域，分别为KH1结构域，Kh3结构域，RGG框以及位于NDF的RNA结合区域。

　　1.1 KH结构域

　　KH结构域首次发现于人不均一核酸核糖核蛋白K（human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K），由大约70个氨基酸残基组成，广泛存在于原核和真核生物的多种蛋白中，一般以多拷贝的形式存在，如在FMRP中存在两个KH结构域，hnRNP K中有三个KH结构域。KH结构域因其二级结构的三维空间折叠方式不同可以分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型是β1α1α2β2β’α’方式，Ⅱ型则是α’β’β1α1α2β2方式，所有典型的KH结构域都有一GXXG环［1］。KH结构域可以与RNA相结合并调节转录与翻译以及细胞的发育。FMRP蛋白的Kh3结构域能与序列特异性的RNA复合物结合，此复合物被称为环环假结体（looploop pseudoknot），或是kissing复合体(kissing complex)，而位于Kh3结构域内的Ile304Asn突变可导致其不能与kissing复合体结合，表明完整的KH结构域是FMRP与靶RNA结合所必需的［2］。

　　1.2 RGG框

　　RGG框是由ArgGlyGly重复片段组成的RNA结合区域，首次发现于人不均一核酸核糖核蛋白U(hnRNP U)的C末端。FMRP蛋白C末端RGG框能与富含鸟嘌呤的RNA结合，此RNA具有Gquadruplex结构（鸟嘌呤四联体），RGG框通过特异性识别Gquadruplex结构而结合RNA。FMRP RGG框可与Sc1 RNA通过疏水键和氢键以及静电作用力相互结合，而这种结合可以增加RNA Gquadruplex结构的稳定性，FMRP RGG框能与靶RNA结合除了靶RNA具备Gquadruplex结构外，还必须具有径环或是stemG quartet连接部位［3］。但Bole等随后的研究表明具有Gquadruplex结构的RNA就足以结合FMRP RGG框，径环结构可能具有校正FMRP RGG框与靶RNA正确结合的功能［4］。

　　1.3 NDF

　　FMRP蛋白的NDF由134个氨基酸残基组成，具有热稳定性和β结构，可形成稳定的二聚体。NDF与已知的任何RNA结合区域都没有同源性，但与“Royal家族”中的Tudor蛋白具有高度同源性［5］。研究显示，FMRP的NDF是由一短的α螺旋连接两个重复的Tudor结构域组成，其中第二个Tudor结构域能与甲基化的赖氨酸及一种82 kD大小的FMRP结合蛋白(82kD FMRP interacting protein，82FIP)相互作用，且NDF还含有一3D的核定位信号，故NDF折叠结构的不稳定性可改变FMRP在细胞核的定位［6］。

　　2 FMRP的功能

　　2.1 FMRP与靶RNA

　　FMRP是一种选择性RNA结合蛋白，通过其功能域可以选择性地与包括自身mRNA和与神经发育、树突可塑性有关的大约4%的脑组织mRNA相结合，对转录，RNA转运，mRNA的稳定性均有作用，因此鉴别其靶RNA是了解FMRP功能及FXS发病机制的关键。Darnell等总结了一系列用于鉴定FMRP靶RNA的方法包括免疫共沉淀、微测量、抗体定位的RNA扩增（antibodypositioned RNA amplication，APRA）、阴性RNA选择策略、交联免疫沉淀等［7］。运用酵母三杂交系统和人类胚胎海马cDNA文库，Zou等鉴别了22种靶mRNA，18种已确证与FMRP有关，而其中有些mRNA可编码结构蛋白，关键酶或是涉及细胞发育全过程的蛋白质，尤其是与神经系统发育和功能有关的蛋白质［8］。FMRP还控制着靶RNA运输与翻译，已阐明FMRP是一种翻译调控因子，但是关于FMRP调节mRNA在神经系统的运输和定位作用尚未明确，运用果蝇mRNA成像系统，Estes首次阐明FMRP可控制mRNA的运输，研究表明mRNA颗粒在FMR1突变的果蝇神经中其能动性和方向性减弱，而在光漂白实验后再进行荧光修复实验中发现mRNA分子的能动性与FMRP的含量有关［9］。FMRP作为信使核蛋白微粒（mRNP）的组成成分影响着脑组织中mRNA稳定性，已鉴定两种mRNA即Nxf1 mRNA和PSD95 mRNA的稳定性与FMRP有关，其中Nxf1 mRNA编码mRNP出核受体大亚单位，而PSD95 mRNA编码鹰架蛋白，FMRP可抑制PSD95 mRNA降解或加速Nxf1 mRNA的降解，因此对涉及mRNA稳定性的FMRPmRNP的进一步研究有助于开拓一条新的途径来研究FMRP的功能及其对FXS的作用［10］。

　　2.2 FMRP是一种翻译调控因子

　　研究已表明，FMRP能与核糖体及mRNP结合形成复合物，影响突触后及树突的具有翻译活性的多聚核糖体的功能而抑制神经细胞的基因表达。Laggerbauer等在体外利用兔网织红细胞和非洲蟾蜍卵细胞研究FMRP，发现FMRP可以与多种mRNA结合（二氢叶酸还原酶mRNA，荧光素酶mRNA，SMN mRNA，FMR1 mRNA）而抑制mRNA翻译，而突变型I304N由于不能形成同源低聚物而不能发挥抑制翻译的功能［11］。Li等同样运用兔网织红细胞裂解系统（RRL）研究FMRP在调节翻译方面的作用时发现，FMRP重组体可以引起剂量依赖性的脑组织多聚腺嘌呤尾RNA翻译抑制但不会导致mRNA降解，而若除去翻译模板上的FMRP结合位点则FMRP不能发挥抑制翻译的作用，表明FMRP与mRNA结合是抑制翻译的关键，从而可推断FMRP可能是一种翻译抑制因子［12］。但是有研究表明，FMRP也可正向调节蛋白的合成：运用各种生物化学技术检测敲除了FMR1基因的小鼠脑组织微管相关蛋白MAP1B和MAP1B mRNA的表达水平，与野生型的相比表达大大降低［13］。研究还发现，FMRP通过一新发现的RNA结合域SoSLIP(Sod1 mRNA Stem Loop interacting with FMRP)结合过氧化物歧化酶 1（Superoxide Dismutase 1）mRNA，SoSLIP具有三叶草结构，FMRP与之结合后可诱导其结构改变而激活翻译，而缺乏FMRP则Sod1的表达减少［14］。由此可以推断FMRP可以双向调节蛋白的合成，从而发挥其相应的功能。

　　2.3 FMRP与树突的可塑性

　　大脑海马和颞叶联合皮层对人的记忆有着非常重要的意义，而FMRP在海马和颞叶联合皮层表达最强，FXS患者因缺乏FMRP而表现为智力低下，提示FMRP对学习和记忆有一定作用。长时程增强和长时程抑制是近几年来研究树突可塑性的两大模块，在敲除了FMRP小鼠的新皮质其长时程增强效应与野生型的相比大大减弱，而此效应的减弱与新皮质的代谢性谷氨酸受体5（metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5)的调节活性有关，若增强mGluR5的调节活性则可增强敲除了FMRP小鼠树突的长时程抑制效应，可以推断FMRP缺乏可改变树突的可塑性［15］。大量定位于额皮质、海马CA3区及嗅球的FMRP经免疫电子显微术观察表明，FMRP表达于突触前末端及轴突内富含实体颗粒的（fragile X granules， FXG）区域内，实验发现FXG表达高峰主要是在神经形成后2～4周，而此期正是突触形成及成熟时期，可以推测FMRP可能在哺乳动物中枢神经系统的实体颗粒发育过程中起着重要的作用［16］。FMRP还与突触的成熟、稳定、及衰老有关。运用电生理学技术和免疫组织化学技术，Pfeiffer等研究了在缺乏FMR1基因的神经元细胞内体外表达FMRP对突触的功能和成熟状态的影响，研究发现，在缺乏FMR1基因的神经元细胞内急性表达突触后FMRP可减少具有功能和结构的突触联接的数量，但不改变突触的成熟状态［17］。还有研究发现，敲除了FMR1基因的小鼠体内，其较长，较薄的树突棘的数量增加而短而粗的树突棘则减少［18］。总结大量的实验研究表明，FMRP缺乏是引起突触的可塑性及结构重塑异常，导致智力低下，记忆，学习能力受损的重要因素。福建医科大学学报 2010年8月 第44卷第4期廖 娟等：脆性X智力低下蛋白结构及功能的研究进展

　　3 与FMRP相互作用的蛋白质

　　3.1 脆性X相关蛋白1与脆性X相关蛋白 2

　　位于常染色体(3q28和17q13.1)与FMR1基因非常相似的基因:脆性X相关基因1（fragile X relative gene 1，FXR1）和脆性X相关基因2（fragile X relative gene 2，FXR2），两者分别编码脆性X相关蛋白1（fragile X relative protein 1，FXR1P）和脆性X相关蛋白2（fragile X relative protein 2，FXR2P），并与FMRP共表达于细胞质，与FMRP有相似的结构，都具有2个KH结构域和RGG框，及核定位信号和核输出信号。FXR1P与FXR2P能与RNA、核糖体及FMRP结合，利用免疫印迹技术发现，FMRP表达水平显著降低，可伴随FXR1P表达的增加，而FXR2P表达则没有变化［19］。

　　3.2 细胞核FMRP结合蛋白1

　　细胞核FMRP结合蛋白1(nuclear FMRP interacting protein 1，NUFIP1)是一位于细胞核内的RNA结合蛋白，具有核浆穿梭的功能，能与FMRP结合而不能与FXR1P和FXR2P结合，并调节突触附近的局部蛋白质合成［20］。

　　3.3 细胞质FMRP结合蛋白1与细胞质FMRP结合蛋白2

　　细胞质FMRP结合蛋白1(cytoplasmic FMRP interacting protein 1，CYFIP1)与细胞质FMRP结合蛋白2(cytoplasmic FMRP interacting protein 2，CYFIP2)具有高度的同源性，CYFIP2能与所有的FXR家族蛋白结合，而CYFIP1只能与FMRP结合［21］。FMRP还可以通过CYFIP1/Sra1而结合翻译抑制因子eIF4E并调节脑组织中FMRP翻译抑制活性，从而调节蛋白质的合成［22］。

　　3.4 82FIP

　　运用酵母双杂交试验发现FMRP能通过其N末端与一种82 kD FMRP结合蛋白（82FIP）结合，82FIP主要分布于胞核和胞质，能与FMRP结合而不能与FXR1P或FXR2P结合，且82FIP的亚细胞分布具有细胞周期依赖性，表明一些含有FMRP的RNP复合物具有调节细胞周期的作用［23］。

　　3.5 KIF3C

　　动力蛋白KIF3C是一新型的FMRP作用蛋白，通过酵母双杂交试验和体外试验表明KIF3C可以与FMRP结合，并与FMRP共同位于包含有FMRP的颗粒中，且研究树突内含有FMRP的RNA颗粒的动力学显示KIF3C可以促进其远程运输，从而可以推测FMRP可能作为RNA颗粒与神经特异性动力蛋白KIF3C之间的分子连接体而促使其可以沿着神经微管运输［24］。

　　3.6 Tdrd3

　　Tdrd3是一种广泛表达的具有Tudor结构域的蛋白，同时还含有一低聚糖/核糖结合区域（OBfold）和一能结合四个泛素的泛素结合区域，一系列生物化学试验揭示了Tdrd3能与FMRP及同源类似物FXR1P和FXR2P结合，而位于Kh3结构域内的I304N突变可导致Tdrd3不能与FMRP结合，可以推测由I304N突变引起的Tdrd3不能与FMRP结合可能是引起FXS的发病机制之一［25］。

　　3.7 其他结合蛋白

　　此外，运用各种生物化学技术，检测到多种能与FMRP相结合的蛋白质，如：YB1/p50，Purα，Staufen和Myosin Va，细胞核微小球蛋白58（microspherule protein 58，MSP58）等［2628］，这些蛋白质通过与FMRP结合影响FMRP调节蛋白质合成的功能，或树突的可塑性等而发挥相应的功能。

　　4 展望
　　
　　随着分子生物学、现代遗传学技术与方法的发展，对FXS的发病机理的研究逐步深入，已确认FMRP是一种RNA结合蛋白，而且也鉴定出多种相关的mRNA及相互作用的蛋白，但是FMRP怎样影响蛋白质合成，如何调节靶mRNA的翻译及对突触的影响仍有待人们进一步探索。同时，FMRP缺乏是如何导致FXS患者的一系列临床表现还未阐明。因此，利用成功的动物模型（果蝇，小鼠）来研究FMRP功能，揭示FXS发病机制是未来的主要研究方向，尤其是破译FMRP与树突可塑性之间的相互关系更是有助于理解许多神经性疾病的分子基础，从而对大脑的功能有一更新的理解。另一方面，如何治疗FXS，缓解病情，有效改善病人的生活质量则是临床医生亟待解决的问题。

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