不同浓度骨髓基质细胞修复大鼠牙周组织缺损的实验研究

　　　　　　 作者：李艳芬 赵欣 闫福华 骆凯 郭建斌 江俊

【摘要】 　　目的 探讨不同浓度骨髓基质细胞（BMSCs）对牙周组织再生的影响。方法 将BMSCs以不同浓度（5×105，5×106，5×107mL-1）与胶原膜BME10X复合培养后，复合物和空白胶原膜BME10X分别植入SD大鼠牙周缺损部位，并覆盖膨体聚四氟乙烯膜（ePTFE膜），以缺损处只覆盖ePTFE膜为对照组，4周后取材，HE染色观察牙周组织再生情况。结果 各实验组新生牙槽骨面积与对照组相比有明显增加（P＜0.05），5×106，5×107 mL-1组的新生牙槽骨量与5×105 mL-1和空白BME10X组比较，差别有统计学意义（P＜0.05），而5×106，5×107，5×105mL-1与空白BME10X组组间比较则无统计学意义（P＞0.05）；各组新生牙骨质面积之间差别无统计学意义（P>0.05）。结论 BMSCs浓度可影响其体内成骨能力，高浓度BMSCs能有效促进牙周组织再生。

【关键词】 组织工程； 引导组织再生，牙周； 牙周组织； 骨髓细胞； 胶原； 疾病模型，动物

　　ABSTRACT: Objective To evaluate the effects of bone marrow stromal cells (BMSCs) with different densities on periodontal regeneration. Methods BMSCs were seeded on the collagen membranes with different concentrations (5×105 mL-1， 5×10 mL-1， and 5×107 mL-1). The complex and collagen membranes without cells were randomly implanted into the periodontal defects in Sprague Dawley rats and covered with ePTFE membranes. The defects with EPTFE membrane alone served as a control. Periodontal regeneration was evaluated by histometric measurements with HE staining at 4 weeks after transplantation. Results Compared with that of the control group， the area of newly formed alveolar bone was significantly increased in all experimental groups (P＜0.05). The area of newly formed alveolar bone of the 5×106 mL-1 and 5×107 mL-1 groups was significantly larger than that of the 5×105mL-1 and blank groups， while new bone formation was not significantly different between the 5×106 mL-1 and 5×107 mL-1 groups， the 5×105 mL-1 and blank groups. There was no significant difference in the area of newly formed cementum. Conclusion BMSCs with different densities can affect the osteogenic capacity in vivo. BMSCs at high concentration can effectively promote the periodontal tissue regeneration.
　　
　　KEY WORDS: tissue engineering; guided tissue regeneration periodontal; periodontal; bone marrow stromal cells; collagen; disease models，animal
　　
　　牙周病造成的牙周附着丧失和牙周骨缺损是临床上急需解决的难点，其主要原因之一是由于牙周缺损处参与牙周组织再生的细胞数量和来源不足。近年来，组织工程技术的发展为牙周组织缺损的修复重建提供了新思路。种子细胞是组织工程学研究中最基本、最重要的环节，大量研究表明，骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）移植可显著促进牙周组织再生［13］，但其有效接种浓度尚未完全明确。本研究将不同浓度BMSCs与胶原膜BME10X复合，植入SD大鼠牙周缺损处，通过组织学观察和测量，探讨细胞接种密度对牙周组织再生的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物及分组

　　清洁级2～3月龄的雄性SD大鼠30只，体质量280～300 g，由上海斯莱克实验动物中心提供［许可证号：SCXX（沪）20070005］。随机抽取25只，每只双侧下颌第一、二磨牙颊侧分别制备牙周缺损区作为实验区域，共50个缺损区，完全随机法分为5组。A组：ePTFE膜组；B组：空白BME组+ePTFE膜；C组：5×105 mL-1组+ePTFE膜；D组：5×106 mL-1组+ePTFE膜；E组：5×107 mL-1组+ePTFE膜。C，D，E组分别用不同浓度的SD大鼠BMSCs与BME10X胶原膜复合培养后植入缺损部位。A组为空白对照组，B，C组为低浓度组，D，E组为高浓度组。

　　1.1.2 主要材料

　　DMEM低糖培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；医用组织引导再生胶原膜BME10X（福建省博特生物科技有限公司）；膨体聚四氟乙烯膜（ePTFE膜，上海市塑料研究所）；瞬康医用胶（北京瞬康科技发展有限公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 SD大鼠BMSCs的分离培养

　　采用文献［4］方法培养SD大鼠BMSCs。选取雄性SD大鼠5只，全麻下消毒、铺巾，取双侧股骨和胫骨，在无菌条件下用10 mL DMEM培养液（含肝素钠50 U/mL）冲洗髓腔，收集细胞，离心1 000 r/min×5 min，弃上清，加入4 mL含15%FBS培养液，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2的孵箱内培养，每隔3 d换液。待细胞生长融合后，用0.25%胰酶+0.1%EDTA消化传代。

　　1.2.2 细胞载体复合物的准备

　　参见文献［5］。胶原膜为0.2 cm×0.4 cm。

　　1.2.3 细胞载体复合物治疗大鼠牙周缺损

　　参照文献［6］的方法，在每只大鼠双侧下颌第一、二磨牙颊侧制备牙周缺损区。全麻下于下颌下缘处切开皮肤，切断咬肌与下颌骨相连的韧带、翻瓣，暴露下颌骨的骨面，确定下颌第一、二磨牙的相对位置。制备近远中向4 mm，颊舌向1 mm，垂直向1.5 mm的缺损，暴露第一磨牙颊侧根面，刮除根面的牙周膜、牙骨质及表层牙本质。根据实验分组处理各个缺损，将细胞载体复合物（细胞面朝缺损区）置于骨缺损处后，覆盖ePTFE膜，生物胶固定，关创缝合。

　　1.2.4 组织标本的制备及观察

　　术后4周处死动物，取下双侧下颌骨标本，常规固定，脱钙，梯度脱水，浸蜡，包埋。制备颊舌向冠状切片（4 μm）。常规HE染色，光镜观察。拍照后以OLYSIA Bioautocell软件测量第一磨牙颊侧根面上新生牙槽骨（new alveolar bone formation，NB）、新生牙骨质（new cementum formation，NC）面积及新生牙周膜（new periodontal ligament，NP）宽度，并对测量结果进行统计学分析。

　　1.2.5 统计学处理

　　数据以x±s表示，采用单因素方差分析（one way ANOVA）分析组间是否存在差别，如存在差别时采用LSD法进行两组间的比较。显著水平α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 大体观察

　　术中因麻醉死亡3只，术后动物苏醒顺利。术后4周处死动物，切开皮肤与肌肉，可见4个样本在牙周缺损区有脓肿形成，弃去不用。

　　2.2 组织学观察及测量

　　制备牙周缺损模型最终的样本数共40个，每组8个样本。组织学观察可见，各组均有不同程度的牙周组织再生，各实验组较单纯ePTFE膜组有更多新生牙槽骨形成。新生牙槽骨矿化程度低，细胞核大、细胞质丰富的成骨细胞密集排列在新生骨表面。高浓度组新生骨相互连接成片，并可见板层骨的形成；低浓度组新生骨结构疏松，板层骨量少，散在分布。各实验组的支架材料均完全吸收；各组覆盖的ePTFE膜保存完整，膜周围有大量炎症细胞浸润（图1）。
　　
　　标本检测显示（表1），各实验组NB均显著大于A组（P＜0.05），其中D，E组与B，C组比较差别有统计学意义（P＜0.05），而B，C组和D，E组组间比较则无统计学意义（P＞0.05）；各组之间NC比较差别无统计学意义（P＞0.05）；各组间NP的比较示，A组与B组差别无统计学意义（P＞0.05），而与C，D，E组的差别有统计学意义（P＜0.05），各实验组之间差别则无统计学意义（P＞0.05）。表1 各组NB、NC面积及NP宽度的测量结果（略）

　　3 讨论
　　
　　牙周组织再生的基础是牙周韧带细胞（periodontal ligment cells， PDLCs），PDLCs是牙周治疗后形成牙周新附着的主要细胞来源，但在牙周病损部位其来源有限，限制了PDLCs作为种子细胞的临床应用，因此有必要寻找一种创伤小或无创伤即可得到的、繁殖能力强的、具有多向分化潜能的细胞用于修复牙周组织缺损。BMSCs来源丰富、取材方便，易于体外培养扩增，定向分化能力强，是组织工程研究中理想的种子细胞。 Kramer等将BMSCs与牙周韧带共同培养7～21 d，免疫组织化学和原位杂交结果表明BMSCs具有 PDLCs的特征［7］：骨钙素和骨桥蛋白表达增强，骨涎蛋白表达减弱，提示BMSCs可用于牙周组织的再生和修复。刘琼等比较了BMSCs与正常人PDLCs表面抗原的表达情况，结果表明PDLCs与BMSCs在表面抗原的表达上相似，该结果可能支持牙周膜干细胞来源于骨髓细胞的假设［8］。因此使用适宜的BMSCs移植入牙周缺损，可以补充牙周缺损局部内源性干细胞数量的不足，因而可能是促进牙周组织缺损再生的有效方法［910］。但相关研究的接种密度差异较大，究竟何种密度最为适宜还未完全明确，若植入细胞浓度太低，会影响细胞间的联系，从而影响细胞的增殖；浓度太高，容易造成细胞堆积，不利于细胞成骨潜能的发挥。因此，本研究选择了三种不同浓度的BMSCs来比较细胞密度对牙周组织再生的影响。
　　
　　实验结果表明，各实验组和对照组都观察到不同程度的牙周组织再生。各实验组牙周骨再生效果优于单纯ePTFE膜组（对照组），高浓度组又优于低浓度组，说明在单纯ePTFE膜的覆盖下缺损部位的组织自身修复速度较缓慢（对照组），较慢的组织生长速度不可避免受到机体内其他不利因素的干扰而影响组织的再生［2］。而BMSCs的植入可使组织再生部位的细胞数量和生物活性增加，在其特定的牙周环境下转化为参与组织再生的前体细胞，并定向分化为多种细胞，加快缺损部位骨的钙化，提高了组织的再生速度和质量，缩短牙周组织再生修复的时间［11］。实验中所用的胶原膜BME10X为生物可降解材料，其主要成分是牛Ⅰ型胶原，为细胞增殖、分化和细胞间的通讯提供了支架，同时在矿化组织的形成过程和成骨诱导中扮演了重要角色［12］。实验中，高浓度组间再生效果无显著性差异，可能是因为细胞数量达到一定浓度后，组织再生量并不一定随细胞数量的增多而增加。这一结果提示，BMSCs的成骨能力可能与细胞的接种密度有关，高浓度的细胞载体复合物可能具有更强的成骨潜能，能有效促进牙周组织的再生。先前的实验研究也证实了这一结果［5，13］。
　　
　　本实验参照文献［6］的方法，经口外切口人工制备SD大鼠牙周缺损模型来研究不同浓度的BMSCs对牙周再生的影响。King等应用重组hBMP2治疗大鼠牙周缺损，术后10 d牙周组织达到早期愈合，38 d完全再生［6］。Huang等用不同浓度的BMP6修复SD大鼠牙周缺损，术后28 d各实验组均出现完全骨再生的现象［12］。金钫等用BMSCs复合胶原治疗大鼠下颌骨缺损，发现实验组2周后就有新骨形成，且新骨形成量逐步增加，4周后缺损修复效果已十分满意［14］。因此，本实验选定实验观察时间为4周，结果表明胶原膜与高浓度的BMSCs复合用于牙周组织工程，在短期内即可成功修复大鼠牙周组织缺损。但BMSCs在牙周组织再生中的确切作用机制还不明确，BMSCs在牙周特定的环境下具体能分化为牙周组织中的何种细胞，如何加快牙周正常组织结构的建立并尽可能缩短再生修复的时间，值得进一步深入研究证实。

参考文献

　　［1］Li H，Yan F，Lei L，et al. Application of autologous cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cells for periodontal regeneration in dogs［J］. Cells Tissues Organs， 2009，190(2):94101.

　　［2］詹暶，闫福华，林敏魁，等. PRP和自体骨髓基质细胞移植修复狗牙Ⅱ度根分叉病变的研究［J］. 口腔医学研究， 2005，21(2):185187.

　　［3］许春姣，郭峰，高清平，等. 骨髓基质干细胞与黄芪壳聚糖/聚乳酸支架对犬牙周骨缺损再生的影响［J］. 中南大学学报， 2006，31(4):512517.

　　［4］刘坤，罗军，娄繁，等. 大鼠骨髓基质细胞的体外培养和鉴定［J］. 中国普外基础与临床杂志， 2009，16(11):875879.

　　［5］詹暶，闫福华，肖毅. 自体骨髓间充质干细胞移植密度与Beagle犬牙Ⅱ度根分叉病变组织修复的关系［J］. 中国组织工程研究与临床康复， 2008，12(16):31933197.

　　［6］King G N，King N，Cruchley A T，et al. Recombinant human bone morphogenetic protein2 promotes wound healing in rat periodontal fenestration defects［J］. J Dent Res， 1997，76(8):14601470.

　　［7］Kramer P R，Nares S，Kramer S F，et al. Mesenchymal stem cells acquire characteristics of cells in the periodontal ligament in vitro［J］. J Dent Res， 2004，83(1):2734.

　　［8］刘琼，谢昊，李五一. 牙周韧带细胞与骨髓基质细胞表面抗原表达的比较［J］. 口腔医学研究， 2005，21(3):250252.

　　［9］宋忠臣，束蓉，谢玉峰，等. 釉基质蛋白联合骨髓基质细胞促进牙周再生［J］. 上海交通大学学报， 2007，27(6):634637.

　　［10］欧龙，马良，王东胜，等. 自体骨髓干细胞移植狗牙周缺损处引导组织再生的实验观察［J］. 现代口腔医学杂志， 2005，19(4):390393.

　　［11］Liu H W，Yacobi R，Savion N，et al. A collagenous cementumderived attachment protein is a marker for progenitors of the mineralized tissueforming cell lineage of the periodontal ligament［J］. J Bone Miner Res， 1997，12(10):16911699.

　　［12］Huang K K，Shen C，Chiang C Y，et al. Effects of bone morphogenetic protein6 on periodontal wound healing in a fenestration defect of rats［J］. J Periodontal Res， 2005，40(1):110.

　　［13］Kawaguchi H，Hirachi A，Hasegawa N，et al. Enhancement of periodontal tissue regeneration by transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells［J］. J Periodontol， 2004 ，75(9):12811287.

　　［14］金钫，段银钟，刘岚，等. 大鼠骨髓基质细胞与胶原复合后修复牙槽骨缺损的研究［J］. 牙体牙髓牙周病杂志， 2007，17(6):313315.