类风湿关节炎患者血清葡萄糖6磷酸异构酶检测及分析

　　　　作者：林珺芳， 陈君敏， 郑玲， 薛原， 芮红兵

【摘要】 　　目的 探讨血清葡萄糖6磷酸异构酶（GPI）浓度对类风湿关节炎（RA）患者的诊断、病情评估和预后判断的意义。 方法 ELISA法检测30例RA患者和30名健康体检者的血清GPI浓度，对GPI浓度与RA患者的体液免疫指标和临床资料进行相关性分析。 结果 （1）RA血清GPI浓度为显著高于健康对照组(P=0.0003)。（2）GPI的阳性检出率与RF、抗CCP抗体的阳性检出率无显著差别，并与RF（r=0.677，P<0.001）和抗CCP抗体（r=0.58，P=0.001）正相关。（3）GPI与ESR（r=0.579，P=0.0008）、DAS28（r=0.589，P=0.0006）和免疫球蛋白（r=0.43，P=0.016）正相关。（4）不同X线分期的RA血清GPI浓度无统计学意义。（5）GPI与关节外受累无关。 结论 GPI可能成为RA的新的标志物，可以作为衡量RA病情活动度的指标，但在预后判断方面的意义有待进一步证实。

【关键词】 葡萄糖6磷酸异构酶； 关节炎，类风湿； 酶联免疫吸附试验

　　ABSTRACT: Objective To evaluate the role of glucose6phosphate isomerase (GPI) in diagnosis，assessment and prognosis of rheumatoid arthritis (RA). Methods The concentration of serum GPI in 30 RA patients and 30 normal controls was measured by ELISA method．The correlation analysis was performed between GPI and humoral immune parameters and clinical data of the RA patients. Results (1) Serum GPI concentration in RA patients was significantly higher than that of normal controls（P=0.0003）. (2) The positive rate of GPI in RA patients was not different from that of rheumatoid factors (RF) and anticyclic citrullinated peptide（antiCCP） antibody. GPI was positively associated with the level of RF （r=0.677，P<0.001）and antiCCP antibody（r=0.58，P=0.001）. (3) GPI was positively associated with erythrocyte sedimentation rate (ESR)（r=0.579，P=0.0008），DAS28（r=0.589，P=0.0006） and immunoglobulin（r=0.43，P=0.016）. (4) No statistical difference in GPI was found between the group with bone erosion and that without bone erosion. (5) No statistical significance was found between GPI and the extraarticular manifestations of RA. Conclusion GPI concentration is of great importance in RA diagnosis and can be a useful indicator to assess the disease activity of RA. But further studies are needed to determine its role in RA prognosis.
　　
　　KEY WORDS: glucose6phosphateisomerase； arthritis，rheumatoid； enzymelinkedimmunosorbent assay

　　类风湿关节炎（RA）患者体内有多种自身抗原和自身抗体，自身抗原或非自身抗原产生的免疫反应是RA产生或持续存在的原因。近年来，人们逐渐认识到葡萄糖6磷酸异构酶（glucose6phosphateisomerase，GPI）是一种自身免疫性抗原，与RA具有高度相关性。本研究检测RA患者血清中GPI抗原浓度，分析其与类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗体的相关性以及与病情活动指标及骨侵蚀、关节外受累之间的关系，探讨其临床意义。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　选择2007年3-6月住院患者30例为RA组，男性8例，女性22例，年龄（52.1±14.3）岁（20～76岁）；诊断均符合1987年美国风湿病学院（ACR）诊断标准。另选择体检中心无肝病、肾病、糖尿病等疾病的健康体检者30名为对照组，男性8名，女性22名，年龄（51.6±13.5）岁（26～75岁）。

　　1.2 标本采集

　　所有RA患者和健康体检者均于清晨空腹抽取静脉血4 mL，3 000 r/min离心10 min，取血清置于-20 ℃冰箱保存，一次溶解后测定。

　　1.3 方法

　　（1）GPI抗原检测。采用上海北加生化试剂有限公司生产的双抗体夹心ELISA GPI检测试剂盒，包括5个GPI标准品（0.00，0.16，0.33，1.00，2.00 mg/L) 和阴、阳性对照，按说明书操作。结果以>0.2 mg/L为阳性。（2）其他。收集RA组的相关临床资料，包括血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗CCP抗体、免疫球蛋白、血浆白蛋白、纤维蛋白原、血常规、尿常规、双手X线正位片、肺部X线或CT检查等。

　　1.4 统计学处理

　　计量资料以x±SD表示，采用SPSS 16.0软件包进行统计学处理。两组计量资料间比较采用WilcoxonTest检验，GPI临界值取值根据受试者工作特征（receiver operating characteristics，ROC）曲线。用McNemar配对χ2检验和Spearman相关分析，评价GPI与RF、抗CCP抗体之间的差异及相关性。GPI与病情活动性相关指标之间的关系分析采用Spearman相关分析。采用KruskalWallis H检验分析GPI与RA患者双手X线分期的关系。采用UTest (MannWhitney) 检验分析GPI与关节外症状之间的关系。所有假设检验的检验水准定为0.05，P＜0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 RA组与对照组GPI检测

　　RA患者血清GPI浓度为（90.84±0.78）mg/L，对照组为（0.20±0.24）mg/L，两者比较差别有统计学意义(T=-3.62，P=0.0003)。

　　2.2 GPI诊断RA的临界点取值

　　假设将GPI作为诊断RA的指标，以不同浓度GPI值计算诊断的灵敏度和特异度。以灵敏度为纵坐标，1特异度为横坐标，建立ROC（图1）。选择最佳临界值为0.22 mg/L， 此时的灵敏度为0.733，特异度为0.867。曲线下面积为0.863，面积>0.5的P值<0.001。

　　2.3 GPI、RF、抗CCP抗体的相关性分析

　　RA组同时检测了GPI与RF，其中29例同时检测了GPI与抗CCP抗体；RF的平均值为（444.23±718.01）RU/mL，抗CCP抗体的平均值为（86.90±88.10）RU/mL。GPI与RF（r=0.677，P＜0.001)、抗CCP抗体（r=0.58，P=0.001）显著相关。以GPI≥0.22 mg/L、RF≥20 RU/mL、抗CCP抗体≥5 RU/mL为阳性（GPI的阳性取值根据上述ROC曲线，RF、抗CCP抗体的阳性取值均根据本院检验科的检测结果），RA组GPI、RF、抗CCP抗体的阳性率分别为73.3%，70%，69%，GPI与RF、抗CCP抗体阳性率检出率差别无统计学意义（表1～2）。表1 GPI与RF在RA的检测结果及相关性（略）表2 GPI与抗CCP抗体在RA中的检测结果及相关性（略）

　　2.4 RA患者GPI浓度与双手X线分期的关系

　　参照文献［1］的RA患者X线分期标准，Ⅰ～Ⅳ期血清GPI浓度差别均无统计学意义（表3）。表3 RA患者GPI浓度与X线分期的关系（略）

　　2.5 GPI与RA病情活动指标的相关性分析

　　通过Spearman相关性分析发现，GPI与ESR、DAS28和免疫球蛋白正相关，与血浆白蛋白负相关，而与CRP、血小板（PLT）、晨僵时间、纤维蛋白原无相关性（表4～5）。表4 GPI与RA病情活动性相关指标Spearman相关性分析（略）表5 GPI在不同晨僵时间的RA患者浓度表达情况（略）

　　2.6 GPI与关节外受累情况

　　RA组中，有19例具有关节外受累的现象，其中肺部受累15例，表现为肺间质病变和或胸膜炎、肺内结节；肾脏受累10例，表现为血尿和/或蛋白尿；四肢血管炎1例，Felty综合征2例，类风湿结节2例。有关节外受累的血清GPI为（0.82±0.85）mg/L，无关节外受累的为（0.88±0.7）mg/L，UTest (MannWhitney)检验两者血清GPI浓度差异无统计学意义（Z=0.97，P=0.33）。

　　3 讨论
　　
　　RA是一类以慢性、对称性、多关节炎为主要表现的自身免疫性疾病，患者体内存在多种自身抗原和相应的自身抗体。GPI是一种多功能蛋白质，分子量60 KD，也称磷酸葡萄糖异构酶或磷酸己糖异构酶，存在于细胞质和细胞外液，尤其是关节腔内。GPI可能通过以下几点引起RA：（1）GPI抗原与GPI抗体结合后沉积在滑膜微动脉和毛细血管内皮细胞壁，通过Fc受体介导和替代途径，使补体激活诱发关节炎。（2）GPI抗原与GPI抗体结合，直接粘附在内皮细胞表面，介导炎症细胞向关节局部的迁移。（3）GPI可以调节基质金属蛋白酶3（matrix melauoproleinase3，MMP3）。MMP3在RA患者的滑膜细胞和血管内皮细胞中高表达，有明显促进骨破坏的作用，能促进淋巴细胞的增殖，GPI可能通过调节MMP3对RA患者的血管增生、滑膜增殖和骨破坏起了重要作用。（4）GPI抗原与抗GPI抗体形成的免疫复合物可以促进细胞因子如TNFa、IL1、IL4、 IL6的表达，促进关节炎症的产生。
　　
　　1996年，Kouskoff意外发现K／BxN小鼠可以出现类似人RA的多发性关节炎，进一步研究发现GPI是K/BxN 鼠模型中关节炎的自身抗原［2］。Schaller最初报道在64%未控制的RA患者血清、关节液中都检测到高浓度抗GPI抗体；但之后Matsumoto等却报道GPI抗体在RA患者中的阳性率很低，平均为15%［34］；Herve等报告了23例RA未检测到GPI抗体［5］。这些报道的差异，可能由于研究方法不同所致，也提示了抗GPI抗体并非RA的特异性和标志性抗体，但是在RA患者的血清及关节液中高浓度的GPI是否对诊断RA、判断RA疾病的活动情况有帮助依然值得研究和探讨。
　　
　　本研究发现，RA组GPI浓度显著高于健康对照组(P=0.0003，约为4倍），GPI在RA患者中具有较高的敏感性（73.3%）和特异性（86.7%），而且GPI的阳性率与RF、抗CCP抗体相似，结合国内外文献有关与易和RA相混淆的疾病比较，RA患者血清GPI浓度是最高的相关报道［68］，有理由认为GPI抗原有可能成为RF、抗CCP抗体以外的又一种RA标记物。当然，本研究所得出的敏感性和特异性是基于以健康对照作出的，如能以其他风湿病对照，结果会更可靠。
　　
　　ESR、CRP、DAS28、晨僵持续时间等均是衡量RA病情活动的指标，而血浆免疫球蛋白升高与血浆白蛋白降低在一定程度上可以反映病情的严重程度。本研究发现，GPI与ESR、DAS28和血浆免疫球蛋白成正相关，而与血浆白蛋白负相关，说明GPI在一定程度上可以作为衡量RA患者病情活动度和判断病情严重程度的指标。但是本研究结果未发现血清GPI浓度与RA患者双手X线分期及关节外症状有相关性，此结果与金跃、Floris等的报道不一致［910］ ，可能因为本研究纳入的病例较少，GPI与骨侵蚀的相关性以及是否对判断RA预后有帮助尚难下定论，需要进一步扩大样本以获取更可靠的证据。
　　
　　笔者认为，GPI抗原检测对RA的诊断、病情评估有重要价值，且ELISA检测方法简单、结果可靠，适用于临床推广应用。

参考文献

　　［1］叶任高. 内科学［M］. 北京:人民卫生出版社， 2000:900.

　　［2］Matsumoto I，Staul A，Benoist C，et al. Arthritis provoked by linkde T and B cell recognition of glycolytic enzyme［J］. Science， 1999，286:17321735.

　　［3］Schaller M，Burton D R，Ditzel H J. Autoantibodies to GPI in rheumatoid arthritis:linkage between an animal model and human disease［J］. Nat Immunol， 2001，2(8):746753.

　　［4］Matsumoto I，Lee D M，GoldbachMansky R，et al. Lowprevalence of antibodies to glucose6phosphate isomerase in patiens with rheumatoid arthritis and a spectrum of other chronic autoimmune disorders［J］. Arthritis Rheum， 2003，48(4):944954.

　　［5］Herve C A，Wait R，Venables P J.Glucose6phosphateisomerase is not a specific autoantigen in rheumatoidarthritis［J］. Rheumatology (Oxford)， 2003，42(8):986988.

　　［6］鲍春德，叶萍，陈晓翔，等. 血清中6磷酸葡萄糖异构酶抗原升高在类风湿关节炎中的意义探讨［J］. 中华风湿病学杂志， 2005，9(5):277279.

　　［7］卿之驹，贾凯，秦立新. 葡萄糖6磷酸异构酶在类风湿关节炎中的诊断意义［J］. 实用预防医学， 2005，12(3):481482.

　　［8］Schaller M，Stohl W，Benoit V，et al. Patients with inflammatory arthritic diseases harbor elevated serum and synovial fluid levels of free and immunecomplexed glucose6phosphate isomerase (G6PI)［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2006，349:838845.

　　［9］金跃，张建明，王书建，等. 血清GPI抗原测定对类风湿关节炎诊断的临床价值［J］. 南京医科大学学报， 2007，27(11):13281329.

　　［10］van Gaalen F A，Toes R E，Ditzel H J，et al. Association of autoantibodies to glucose6phosphate isomerase with extraarticular complications in rheumatoid arthritis［J］. Arthritis Rheum， 2004，50(2):395399.