应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因

　　　　 作者：张雷，马清涌，孟宪魁，李康，成军

【摘要】 目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建NS5ABP37反式激活相关基因差异表达的cDNA文库，筛选NS5ABP37蛋白反式激活相关基因。方法 以表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ABP37转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)为对照，从转染后的细胞裂解液中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切消化后将实验组cDNA分成两组，分别衔接两种不同接头，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应;第2次PCR产物与pGEMT easy克隆载体连接，构建cDNA消减文库，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了人NS5ABP37蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库。扩增后得到60个200～1000bp插入片段的克隆，随机挑选其中20个测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得9种已知功能编码基因。结论 NS5ABP37基因功能涉及细胞生长调节、信号转导和能量代谢。

【关键词】 抑制性消减杂交;NS5ABP37;丙型肝炎病毒;cDNA文库

ABSTRACT: Objective To screen and identify human genes transactivated by NS5ABP37 by constructing a cDNA subtractive library with suppression subtractive hybridization (SSH) technique. Methods SSH and bioinformatics techniques were used for screening and cloning of the target genes transactivated by NS5ABP37 protein. After pcDNA3.1(-)NS5ABP37 and pcDNA3.1(-) empty vector transfected HepG2 cells， the mRNA was isolated from the cells. SSH method was employed to analyze the differentially expressed DNA sequence in the two groups. After restriction enzyme RsaⅠ digestion， smallsized cDNAs were obtained. Then tester cDNA was pided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2， respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR， the second PCR production was subcloned into pGEMT easy plasmid vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E.coli strain DH5α. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blastn search after PCR. Results The subtractive library of genes transactivated by NS5ABP37 was constructed successfully. The amplified library contained 60 positive clones with 200-1000bp inserts. Sequence analysis was performed in 20 clones randomly， and the fulllength sequences were obtained with bioinformatics method. Altogether 9 coding sequences were obtained. Conclusion The function of NS5ABP37 gene may be involved in cell growth regulation， signal transduction and metabolism.

　　KEY WORDS: suppression subtractive hybridization; NS5ABP37; hepatitis C virus; cDNA library

　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus， HCV)非结构蛋白5A(NS5A)是HCV基因组编码的一种最为重要的、具有反式激活作用等多种生物学活性的非结构蛋白质[13]。本课题组王琳等[4]利用酵母双杂交技术对肝细胞中能与HCV NS5A蛋白相互结合的蛋白进行了筛选，最终确定包括3种GenBank中无同源序列的新基因的蛋白基因共14种。根据酵母双杂交系统肝细胞文库建立原则、终止密码子位置和pACT2质粒序列情况，电子拼接推定该基因的开放读码框架获得相应的全长编码序列，将其中一个开放读码框长为1488bp，编码495个氨基酸残基的新基因命名为NS5ABP37，并提交GenBank获得注册号(AF543840)。为深入探讨NS5ABP37的生物学功能，我们构建了pCDNA3.1(-)NS5ABP37真核表达载体，应用抑制性消减杂交技术筛选了NS5ABP37的反式激活基因。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞、pcDNA3.1(-)质粒及大肠杆菌DH5α为本室保存。Quickprep mico mRNA Purification试剂盒、PCRSelect cDNA Subtraction试剂盒、50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech);Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen);Wizard Purefection Plasmid DNA Purification System试剂盒、High Pure PCR Product Purification试剂盒、T4 DNA连接酶、pGEMT、IPTG、XβGal、T7和SP6通用引物及pGEMTeasy载体(Promega);Taq酶(鼎国);EcoRⅤ、HindⅢ、NheⅠ(TaKaRa);玻璃奶回收试剂盒(博大泰克)。DNA测序由上海生工公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 真核表达载体的构建 根据NS5ABP37基因序列设计特异引物(P1 5′GATATCATGACGGAGCCCGAAGACGTA3′和P2 5′AAGCTTTT

　　ACTTCATTAAGAAGTACTG3′)并进行PCR扩增，将扩增产物与pGEMT载体连接，转化大肠杆菌后行酶切鉴定并测序。将鉴定正确的目的基因与pcDNA3.1(-)真核表达载体连接，再次转化大肠杆菌并用碱裂解法提取质粒后进行EcoRⅤ/HindⅢ酶切分析，鉴定正确后用Wizard Purefection Plasmid DNA Purification System试剂盒提取质粒，准备转染。

　　1.2.2 真核表达载体的细胞转染及mRNA提取 用10μL的Lipofectamine 2000转染试剂将4μg pCDNA3.1(-)NS5ABP37重组质粒及 pcDNA3.1(-)空质粒分别转染35mm平皿的HepG2细胞，48h后收获细胞。用Quickprep mico mRNA Purification试剂盒提取转染重组质粒和空载体的HepG2细胞的mRMA，经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计进行定性、定量分析。

　　1.2.3 消减杂交文库的建立 采用PCRSelect cDNA Subtraction试剂盒，按SSH方法说明书进行。以转染重组质粒和空载体的HepG2细胞的mRNA为模板逆转录合成cDNA(dscDNA)，并分别标记为实验组(tester)和驱动组(driver)，经RsaⅠ(一种识别4碱基序列的酶)消化的dscDNA形成平头末端片段。把实验组cDNA均分为两份，分别与试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头1和2R连接，然后与过量驱动组cDNA杂交;合并两种杂交产物后再继续与变性的驱动组cDNA进行第2次杂交;经巢式PCR扩增消减杂交的cDNA，使实验组cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。

　　1.2.4 消减杂交文库的扩增和克隆分析 用High Pure PCR Product Purification试剂盒纯化2次PCR扩增后的产物，并将纯化产物与pGEM TEasy vector 16℃连接过夜，转化DH5α高效感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB/Xβgal/IPTG培养平板上，37℃培养18h。挑白色菌落，以pGEMT easy载体多克隆酶切位点两端的T7/SP6通用引物进行菌落PCR扩增，反应条件如下：95℃ 7min，(94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min)×35，72℃ 10min;4℃ hold。经10g/L琼脂糖凝胶电泳证明含有插入片段(200～1000bp)后测序。应用生物信息学将测序结果进行GenBank数据库的同源性分析。

　　2 结 果

　　2.1 pCDNA3.1(-)NS5ABP37真核表达载体的构建 RTPCR扩增NS5ABP37基因与pGEMT载体连接，测序正确，酶切与pcDNA3.1(-)连接，再进行酶切鉴定。

　　2.2 mRNA的定量、定性分析 紫外分光检测显示，转染了pCDNA3.1(-)NS5ABP37和pCDNA3.1(-)空载体的HepG2细胞的mRNA分别为4.53μg和4.18μg。10g/L琼脂糖凝胶电泳可见mRNA为大于0.5kb清晰慧尾片状条带。

　　2.3 cDNA消减文库的消减效率分析 实验组连上接头并进行消减杂交及巢式PCR后，将消减cDNA第2次PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见已消减的cDNA与未消减cDNA条带分布明显不同，表明实验组和驱动组中相同表达的基因已被消减。以消减及未消减PCR产物为模板，用G3PDH引物进行PCR扩增，分别在第18、23、28、33次循环结束时从反应体系中吸取5μL进行20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。与未消减组PCR产物相比，消减组PCR产物中G3PDH基因产物大大减少，说明所构建的消减文库具有很高的消减效率(图2)。

　　2.4 差异表达cDNA片段的扩增及克隆 消减杂交产物经两轮PCR扩增后，纯化并与pGEMT easy载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞后，铺于含有氨苄青霉素的LB/Xβgal/IPTG培养平板上进行蓝白斑筛选，对阳性克隆用SP6、T7通用引物进行菌落PCR。结果显示插入片段在200～1000bp不等，所得的克隆中都有插入片段，这些条带代表差异表达的基因片段(图3)。

　　2.5 DNA测序及同源性分析的初步结果 随机挑选其中的20个克隆进行测序，与GenBank数据库进行初步比较，其中18个克隆均与已知基因的部分序列高度同源，详细结果见表1表1 阳性克隆与GenBank同源序列的比较

　　3 讨 论

　　抑制性消减杂交技术(SSH)由DIATCHENKO等[56]建立，其原理是在抑制性PCR的基础上进行消减杂交，主要用于筛选差异表达基因。抑制性PCR利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端的反向重复序列在退火时产生锅柄样(panhandle like)互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性地抑制非目的基因片段的扩增。消减杂交去除了实验方的同源序列，具有快速、灵敏、高效的特点，有利于检出某些低丰度表达的mRNA，因此被广泛应用。

　　蛋白激酶C(PKC)是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号传递过程中起着重要作用。PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞中，可以引起多种底物蛋白质的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，使其底物蛋白质构象发生改变，从而激活离子交换、Ca2+通道、水解膜磷酯，肌丝收缩，使mRNA合成增加，发挥其调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化的生物学作用。除此之外，PKC底物80KH(PRKCSH)与常染色体上显性多囊肝病相关。目前研究认为，编码肝胱氨酸(hepatocystin)蛋白的PKC底物80KH基因的突变是多囊肝的发病机制中的重要环节[79]。

　　人类分类连接蛋白5属于分类连接蛋白家族，该家族成员均有一个PX保守氨基酸序列。研究表明PX序列能够与磷脂酰肌醇结合，参与细胞信号转导[10]。

　　CDC28蛋白激酶属于细胞周期素依赖性激酶(CDK)家族，是细胞由G1期到S期、G2期到M期必需分子，影响着细胞分裂的过程[11]。近年研究认为CDK在慢性肝炎向肝细胞癌(HCC)的转换过程中具有十分重要的意义[12]。 细胞色素氧化酶C 亚单位Ⅱ是细胞色素氧化酶C的催化核心结构，由线粒体DNA编码，在人类一些恶性程度较高的肿瘤的发生过程中起着一定的作用[13]。

　　通过对NS5ABP37上述反式激活基因的分析，我们发现其与信号转导、细胞周期调节以及能量代谢关系密切。我们推测，NS5A的反式激活作用有可能是通过NS5ABP37与其他体内分子的相互影响来发挥的。NS5ABP37抑制性消减文库的建立为研究其功能提供了理论依据，并为HCV致癌机制提供了新的研究方向。

参考文献

　　[1]成军. 丙型肝炎病毒基因的干扰素敏感决定区 [J]. 国外医学·流行病学传染病学分册， 2000， 27(2):5558.

　　[2]钟彦伟，成军，陈新华，等. 应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒NS5A抗原模拟表位 [J]. 世界华人消化杂志， 2002， 10(2):133136.

　　[3]成军，钟彦伟，施双双，等. HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定 [J]. 中华实验与临床病毒学杂志， 2001， 15(3):216218.

　　[4]王琳，李克，成军，等. 筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白基因 [J]. 解放军医学杂志， 2003， 28(1):5052.

　　[5]王春花，成军，郎振为，等. 基因表达谱芯片技术筛选XTP3蛋白反式调节基因 [C]//第一届全国人工肝及血液净化学术年会暨全国人工肝及血液净化攻关协作小组成立大会论文集. 2004.

　　[6]王春花，成军，闫惠平. 应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因 [J]. 解放军医学杂志， 2005， 30(2):127129.

　　[7]PECES R， DRENTH J， TE MORSCHE R， et al. Autosomal dominant polycystic liver disease in a family without polycystic kidney disease associated with a novel missense protein kinase C substrate 80KH mutation [J]. World J Gastroenterol， 2005， 11(48):76907693.

　　[8]DRENTH JP， DE MORSCHE RH， SMINK R， et al. Germline mutations in PRKCSH are associated with autosomal dominant polycystic liver disease [J]. Nat Genet， 2003， 33(3):345347.

　　[9]HODGKINSON CP， MANDER A， SALE GJ. Identification of 80KH as a protein involved in GLUT4 vesicle trafficking [J]. Biochem J， 2005， 388(Pt 3):785793.

　　[10]COZIER GE， CARLTON J， MCGREGOR AH， et al.The phox homology (PX) domaindependent， 3phosphoinositide mediated association of sorting nexin1 with an early sorting endosomal compartment is required for its ability to regulate epidermal growth factor receptor degradation [J]. J Biol Chem， 2002， 277(50):4873048736.

　　[11]RUSSO GL， VAN DENBOS C， SUTTON A， et al. Phosphorylation of Cdc28 and regulation of cell size by the protein kinase CKII in Saccharomyces cerevisiae [J]. Biochem J， 2000， 351(Pt1):143150.

　　[12]成军，刘妍，洪源，等. 乙型和丙型肝炎病毒对细胞周期素及细胞周期素依赖性蛋白激酶的调节 [J]. 世界华人消化杂志， 2003， 11(8):12551258.

　　[13]HERRMANN PC， GILLESPIE JW， CHARBONEAU L， et al. Mitochondrial proteome: altered cytochrome C oxidase subunit levels in prostate cancer [J]. Proteomics， 2003， 3(9):18011810