内皮抑素联合放射对人肺腺癌A549细胞的作用

【摘要】 目的 研究放射联合内皮抑素对肺腺癌细胞系A549的作用以及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 ①以不同浓度的内皮抑素与A549细胞作用不同时间，MTT法选择生长抑制率≤20%的药物浓度(IC20);②将细胞分为对照组，单纯照射组，单纯用药组，药物与照射联合组，联合组分3个亚组，分别为加药培养24h、48h及72h后再照射2Gy。比较细胞存活分数，选择最佳药物作用时间;③用200mg/L药物浓度作用实验组，药物作用48h后X线0、2、4、6、8Gy剂量照射，绘制细胞存活曲线，与单纯照射组比较，计算增敏比(SER);④ELISA法检测各组细胞上清液中VEGF值。结果 200mg/L浓度内皮抑素的放射增敏作用在药物作用48h后最为明显，增敏比为1.61、1.04;放射联合内皮抑素可降低肺癌细胞放射治疗后VEGF水平的表达。结论 内皮抑素对离体非小细胞肺癌A549细胞系具有放射增敏作用，且最佳照射时间为药物作用后48h，其增加放射敏感性可能的机制为降低肿瘤细胞VEGF的水平。

【关键词】 癌;非小细胞肺;细胞系;肿瘤;内皮抑素;放射增敏

ABSTRACT: Objective To study the synergistic effect of endostatin (YH16) and irradiation on human nonsmall cell lung cancer (NSCLC) cell line A549 and the expression level of vascular endothefial growth factor. Methods ① A549 cells were exposed to various concentrations of endostatin for different time. The optimal concentration giving ≤20% inhibition concentration (IC20) by MTT assay was selected. ② The cells were pided into 4 groups: control group， chemotherapy alone， radiotherapy alone， and radiochemotherapy group. All groups were exposed in distinct treatment， the cells survival fraction and the plating efficiency of the four groups provided to select the optimal radiotherapy dosage. ③ The radiochemotherapy group had been exposed to endostatin for 48 hours， followed by irradiation at 48 hours with various doses: 0， 2， 4， 6， 8Gy. After 14 days， the cell clonogenic survival curves and the SER were evaluated. ④ Detect the different groups VEGF value by ELISA kit. Results Incubating cells in 200mg/L endostatin culture medium the value of SER radiated by linear accelerator in 2Gy after 48h were 1.61 and 1.04. And endostatin with proper dosage and radioexposure time could decrease the VEGF level. Conlusion It is suggested that endostatin enhances the radiosensitivity of NSCLC A549 cell line in vitro (SER=1.61， 1.04). The enhancement depends on the time of exposure drug. The optimal radiation time should be 48 hour after exposure.

　　KEY WORDS: carcinoma; nonsmall cell lung; cell line; tumor; endostatin (YH16); radiation sensitizing agents

　肺癌是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，且发病率日趋上升。其治疗需要采用综合治疗，而放疗作为治疗局部晚期非小细胞肺癌的重要手段，失败的主要原因是局部复发和远处转移，且时有放射性肺炎的发生。提高非小细胞肺癌放射治疗的治愈率，其关键在于提高肿瘤组织对放射线的敏感性，在相同剂量的照射下获得更高的临床增益。内皮抑素作为抗血管生成抑制剂，已有国内外文献报道其与放射线联合应用能提高多种移植瘤模型中肿瘤的局部控制率而不增加毒副作用。但其可能的作用机制尚不是很清楚。本实验选用A549肺腺癌细胞系，就内皮抑素是否可以增加该细胞系的体外放射敏感性作初步探讨，旨在为临床上使用内皮抑素同步放射治疗非小细胞肺癌提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及主要试剂 人肺腺癌细胞A549购自中国医学科学院肿瘤研究所。本实验所用重组人血管内皮抑素注射液(恩度.Endostar)由江苏先声药业提供。PRMI1640培养液，胰蛋白酶为Invitrogen Gibco公司产品。胎牛血清购自杭州四季青生物公司。噻唑蓝(MTT)为Sigma公司生产。人VEGF ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。

　　1.2 细胞培养 A549培养于PRMI1640培养液(含mL/L热灭活小牛血清，青霉素100mg/L及链霉素100mg/L)中，置于37℃，50mL/L CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞经过2.5g/L胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。

　　1.3 MTT法检测内皮抑素对A549细胞的毒性 选取对数生长期的A549细胞接种于96孔板，经胰酶消化，血球计数板上计数，确保活细胞在97%以上，调整细胞浓度2×104/mL，100μL每孔，加入96孔培养板中。将培养板放入37℃，50mL/L CO2培养箱培养，待细胞贴壁后取出，加入不同浓度内皮抑素，使其终浓度为500、100、50、25、10、5、1、0.5、0.1g/L。每个浓度设置5个复孔。同时设空白对照组和调零孔。培养板放回培养箱中分别继续培养24、48、72h。取出培养板每孔加入50μL MTT(5g/L)。再将培养板放回培养箱中培养4h。吸出上清液以PBS洗涤1次，加入150μL DMSO。在平板摇床摇10min使甲臜完全溶解。用酶标仪测490nm波长处的吸光度值(A)，实验重复3次，取平均值。按照下式计算各个药物浓度的细胞存活抑制率：抑制率=(PBS对照组A490-药物组A490)/PBS对照组A490×100%。以不同药物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线。

　　1.4 最佳照射时间(T)的测定 取生长良好的A549细胞接种至6孔板中，每孔细胞数400个，全培养液2mL，标准状态下培养24h后弃培液，PBS液洗涤2次。分为①对照组，②单纯照射组，③单纯用药组，④药物与照射联合组。④组分3个亚组，分别为加药培养24h、48h及72h后再照射2Gy。用200mg/L的内皮抑素作用③组和④组24h、48h及72h后吸去含药培液，PBS液洗涤2次后，加入全培养液2mL。②组及④组行X线照射2Gy(直线加速器为Siemens primus，6MV Xray，剂量率3Gy/min，SSD 100cm，加2cm等效组织，照射面积为15cm×15cm)。标准条件下继续培养各组细胞14d后，弃掉培养液，洗涤、固定、染色后，计数各孔细胞数≥50个的细胞集落数。按细胞存活分数= (处理组集落形成数/处理组种植细胞数×对照组集落形成率)×100%，计算A549细胞集落形成率，不同处理组的细胞存活分数。实验重复4次，求得最佳抑制的药物作用时间即最佳照射时间(T)。

　　1.5 克隆形成实验 将指数生长期A549细胞接种于100mm培养皿，培养24h细胞贴壁后，分4组进行实验。对照组：不做任何处理;药物组：200mg/L内皮抑素作用T时间;照射组：X线照射;实验组：200mg/L内皮抑素作用T时间+X线照射。对照组和药物组于细胞贴壁后分别更换不含/含200mg/L内皮抑素培养液继续培养T时间，2.5g/L胰酶消化，台盼兰检测细胞活性并计数活细胞。按100个/皿接种于60mm培养皿，无药培养液继续培养14d。照射组及实验组中设不同照射剂量亚组。细胞贴壁后，实验组更换含200mg/L内皮抑素培养液，继续培养T时间。之后给予0、2、4、6、8Gy X ray照射(直线加速器为Siemens primus，6MV X ray，剂量率3Gy/min，SSD 100cm，加2cm等效组织，照射面积为15cm×15cm)。照射后，2.5g/L胰酶消化细胞，台盼兰检测细胞活性，并计数活细胞，根据不同照射剂量(由低到高)，分别接种100、500、500、2000、2000个细胞于60mm培养皿。无药物培养液培养14d，甲醇/乙酸(3∶1)固定，结晶紫染色，计数大于50细胞的克隆数。实验重复3次。克隆形成率(PE)=(克隆数/接种细胞数)×100%，多靶单击模型拟合细胞存活曲线，计算D0值、Dq值。计算所得克隆形成率经单纯内皮抑素处理组校正其对细胞的作用。

　　1.6 ELISA法测各组的VEGF值 按照试剂盒说明进行操作，得出以上各组细胞上清液的VEGF值。

　　1.7 统计学方法 率的比较经χ2检验;细胞存活曲线采用多靶单击方程经Sigma Plot 10.0软件拟合;样本均数的比较使用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 内皮抑素对A549细胞生长的抑制作用 不同浓度的内皮抑素处理A549细胞不同时间后，与对照组相比，低浓度的内皮抑素(0.1mg/L)作用24h对A549有轻微的促进增殖作用，而其他浓度和作用时间的内皮抑素对A549的生长均有不同程度的抑制，表现为A490值降低，抑制率升高(表1)。表1 内皮抑素对A549细胞生长抑制率的影响

　　内皮抑素实验浓度曲线及IC20的选取：9个梯度浓度内皮抑素作用A549细胞24h后，用MTT法测得细胞存活率曲线(图1)，从曲线上获得IC20为230.747mg/L。在随后的实验中内皮抑素的浓度均不大于IC20。选取200mg/L内皮抑素浓度进行后续实验。

　　2.2 最佳照射时间(T)的测定 如表2所示，单纯照射组细胞存活分数为(0.592±0.042)%，与药物作用24h后照射组比较差异无显著意义(χ2=0.24， P>0.05)。随着药物作用时间的延长，细胞存活分数下降，药物作用48h后细胞存活分数照射组与单纯照射组比较有显著差异(χ2=17.31， P<0.05)，药物作用72h后照射细胞存活分数为(0.552±0.030)%，与单纯照射组比较亦无显著差异(χ2=1.31， P>0.05)。说明200mg/L内皮抑素对A549细胞的放射作用具有时间依赖性，在药物预先作用48h最为明显。因此，实验选择药物作用48h后再照射。

　　2.3 200mg/L内皮抑素在最佳放射时间对A549细胞的增敏效应 200mg/L内皮抑素处理48h后，可见增加A549细胞的放射敏感性(图2)。联合组细胞存活曲线较单纯照射组整体下移，特别是提高了曲线的肩区，使肩峰明显缩短。Dq、D0值在单纯照射组为2.45Gy、1.80Gy，而在联合组分别降为1.52Gy、1.72Gy。放射增敏比(sensitization enhancement ratio， SER)分别为1.61(Dq之比)、1.04(D0之比)。表2 200mg/L内皮抑素与A549细胞作用不同时间后照射2Gy的细胞存活分数

　　2.4 放疗联合内皮抑素对A549细胞VEGF表达的影响 如表3所示，药物联合放射能有效降低A549细胞放疗后VEGF的表达，t=2.550，每组设9个复孔，v=16，t0.05，16=2.210，P<0.05。表3 各组细胞上清液VEGF的水平

　　3 讨 论

　　放射治疗是肿瘤治疗的一种有效手段，在临床上约有一半的肿瘤患者在治疗过程中接受过放射治疗。但是，单独接受放射治疗治愈率并不高。因此，寻找高效低毒的放射增敏剂是当前研究的热点。

　　肿瘤的发生发展离不开血管生成，肿瘤对血管生长的依赖关系，提示肿瘤细胞和内皮细胞是肿瘤治疗的两个潜在靶点[1]。抗血管生成治疗是这些年发展起来的抗肿瘤疗法，同时作用于肿瘤细胞和内皮细胞是其重要特点。随着研究深入，发现单独使用抗血管生成治疗的抗肿瘤疗效并不理想。目前已有动物实验证明联合运用抗血管生成治疗和放射治疗可以大大提高肿瘤治愈率[2]。

　　内皮抑素是近年来发现的被认为最有效的血管生成抑制剂之一，其能够抑制肿瘤血管生成，抗肿瘤生长、侵袭和转移，且具有治疗后不易复发、反复应用不产生耐药性和不良反应低等优点[3]。近来有研究发现，内皮抑素抑制细胞迁移作用是非内皮细胞特异的，重组人内皮抑素不仅可抑制人舌鳞状细胞癌的增殖和迁移[4]，而且可直接抑制头、颈鳞状细胞癌细胞(HNSCC)的迁移和侵袭[5]。也有研究证实，人内皮抑素能抑制膀胱癌细胞EJ的增殖，并促进EJ凋亡[6]。

　　因此，本实验中，以人肺腺癌细胞系A549为研究对象，以不同浓度内皮抑素作用于A549细胞不同时间。内皮抑素对A549细胞细胞增殖具有一定抑制作用并有时间(24、48、72h)和浓度(0.1～500mg/L)依赖性，同时也可以观察到细胞形态学的改变。MTT法证实，在200mg/L的药物浓度下(低于IC20)，肿瘤细胞生长受到一定的抑制，但细胞存活率≥80%与对照组差别不显著，因此可以认为是作用充分而无效杀伤A549细胞的最大剂量。这说明，内皮抑素并非单纯以血管内皮细胞为作用靶点，其亦可直接作用于一些肿瘤细胞，对肿瘤细胞的增殖转移产生抑制作用。进一步实验发现内皮抑素对A549细胞具有一定的放射增敏作用，其SER为1.61、1.04，而这种增敏效应在药物预先作用48h后表现出来。推断其机制可能为药物改变肿瘤细胞周期所致。且放射联合内皮抑素药物作用能有效降低A549细胞上清液的VEGF水平，与单纯照射组和对照组比较有显著差异(P<0.05)。这与动物实验所取得的结果一致[78]。放射是以肿瘤细胞为靶点的治疗措施，通过对肿瘤细胞的杀灭来控制其生长。放射在杀灭瘤细胞的同时又诱导肿瘤细胞表达VEGF升高，保护血管内皮细胞抗拒放射线攻击，促进肿瘤血管形成[9]，或通过提高肿瘤细胞基质分解酶活性，增强瘤细胞的侵袭力[10]，因而放射诱导了肿瘤的保护机制，降低瘤细胞对放射线的敏感性。本实验中内皮抑素抑制了肿瘤细胞VEGF的表达，降低使肿瘤赖以生长及转移的血管生成，且本身具有抗肿瘤作用，又能通过降低VEGF表达使血管内皮细胞失去免受放射线攻击的保护，增强瘤细胞的放射敏感性。因而，我们认为内皮抑素与放射起到了协同抑瘤作用，此协同作用并不是各自作用的简单合并，而是起到了效应的放大。

　　我们的研究结果提示，内皮抑素联合放射治疗对体外肺腺癌细胞系A549具有放射增敏作用，其机制可能与改变细胞周期和下调肿瘤细胞VEGF表达有关，为内皮抑素结合放射治疗的临床应用提供了实验依据。但是，肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，体外细胞系和体内环境有一定的差距，其在体内的放射增敏现象和可能的机制尚待进一步研究。

参考文献

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