不同品系大鼠哮喘模型的比较

　　　　 作者：龙静雯，马卓，杨旭东，刘静，吕社民，曹永孝

【摘要】 　　目的 比较不同品系大鼠哮喘模型的表现特征。方法 用卵蛋白和氢氧化铝诱导DA、DA.1u、E3、DE和SD品系大鼠哮喘模型，比较它们的肺指数，迟发超敏反应，肺泡灌洗液中的白细胞数、嗜酸粒细胞所占比例，血清中的一氧化氮、IgE含量，肺组织病理变化和叶支气管内皮素B受体的收缩功能、β受体的舒张功能。结果 E3、DE和SD哮喘模型大鼠的耳廓肿胀度均显著增高，E3哮喘大鼠的肺泡灌洗液中的嗜酸细胞、血清中IgE显著增加、β受体介导的支气管舒张功能下降；E3和SD哮喘大鼠内皮素B受体介导的支气管收缩功能增强。其余品系大鼠的指标有变化趋势，但差异无显著性。各品系哮喘大鼠的肺指数、肺泡灌洗液中的白细胞数、血清中NO含量的变化均无显著性差异。结论 DA、DA.1u、E3、DE和SD品系大鼠哮喘模型的各指标均有不同程度变化，而E3大鼠的变化最为突出，与人类哮喘病理生理变化相似。

【关键词】 大鼠；哮喘模型；肺泡灌洗液；支气管

　　ABSTRACT: Objective To compare the phenomenal characteristics of asthma models in 5breed rats. Methods The asthma models in DA， DAlu， E3， DE and SD rats were prepared by ovalbumin (OVA) and aluminum hydroxide (Alum). The lung index， delayedtype hypersensitivity， the number of leukocytes and eosinophil ratio in bronchoalveolar lavage fluid， serum IgE and NO levels， pathological changes of lung tissues， contraction function of bronchal ETB receptor agonist， and dilation function mediated by βreceptor were examined. Results Ear swelling became obviously increased in E3， DE and SD asthma rats. The ratio of eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid and serum IgE increased， and dilatation function of bronchi mediated by βreceptor decreased obviously in E3 asthma rats. The contraction function of bronchi mediated by ETB receptor increased in E3 and SD asthma rats. No significant changes in lung index， the number of leukocytes in bronchoalveolar lavage fluid， or serum NO level were found in the 5breed asthma rats. Conclusion The phenomenal characteristics altered in DA， DA.1u， E3， DE and DS asthma model rats. The changes were most obvious in E3 rats， which is similar to human allergic asthma in pathophysiology.

　　KEY WORDS: rat; asthma model; bronchoalveolar lavage fluid; bronchus

　　哮喘是威胁人类健康的呼吸道慢性非特异性炎症性疾病，发病机制复杂、病理生理机制不明确是导致其防治困难的重要原因。因此，确定病因、探索发病机制、寻找治疗方法、研制有效药物有重要意义[1]。但是，许多临床实验在方法上受到限制，在人体深入探讨该病的发病机理及预防、治疗机理有一定困难。因而，制备接近人类哮喘病理生理状态的哮喘动物模型在整个研究中具有重要作用[2]。目前，所用的哮喘动物模型各有特点，但未见对其进行系统比较，难以判定其优劣性。大鼠因其品系纯、来源广、对抗原反应较为一致、易产生迟发相哮喘反应、反应出现的时间与哮喘患者接近、并有嗜酸粒细胞浸润和气道反应性增加等特点，因而近年来大鼠模型使用逐渐增多。国外多用BrownNorway大鼠，这种模型是目前国际上使用的主要大鼠模型；我国主要使用SD和Wistar大鼠模型[3]。本实验建立了E3大鼠的哮喘模型，并与另外4种品系大鼠的哮喘模型进行了比较。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品和试剂

　　卵蛋白(OVA)、氢氧化铝(Alum)、5羟色胺(5HT)、内皮素(ET)1、S6c 购自Sigma公司；乙酰胆碱(ACh)购自上海雪满生物科技有限公司；盐酸异丙肾上腺素(IP)购自上海禾丰制药有限公司。

　　1.2 仪器与设备

　　BL820S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；JH2肌张力传感器(北京航天医学工程研究所)；TG328B电光分析天平(上海天平仪器厂)；XTZE型连续变倍体视显微镜(上海光学仪器厂)。

　　1.3 实验动物

　　DA、DA.1u、E3大鼠自瑞典隆德大学引进(中华人民共和国进境动植物检疫许可证编号AC000400108)，本室SPF级动物房繁育，室温(25±3)℃，相对湿度40%～60%，每日人工照明12h，无菌操作。DE为DA×E3的杂交一代。均8～12周龄。SD大鼠，合格证号：陕动证字08005号，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。每个品种选8只动物，体重均180～220g，雌雄兼用。

　　1.4 哮喘模型的制备[4]

　　5种品种大鼠随机分为对照组和模型组。模型组大鼠腹腔注射OVAAlum悬浮液1mL(1mg OVA+50mg Alum溶于PBS液中)免疫，正常组大鼠腹腔注射PBS液1mL。2周后模型组大鼠鼻腔每孔滴1mg/mL的OVAPBS悬浮液50μL攻击，每日1次，连续7d；对照组大鼠用PBS液替代，同法操作。末次攻击的同时在各组大鼠的右耳注射1mg/mL的OVAPBS悬浮液20μL，左耳注射PBS液20μL。

　　末次攻击24h后，乙醚麻醉，称重；腹主动脉取血，3000r/min离心15min，分离血清，用ELISA法测血清IgE：血清样品用PBS液稀释5倍后加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，洗板3次；生物素化的小鼠抗大鼠IgE以1∶500稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，洗板3次；辣根酶标记链亲和素以1∶800稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育反应30min，洗板3次；加入TMB底物显色液，100μL/孔，37℃孵育反应30min，加入100mL/L h3SO4终止液100μL/孔终止反应，酶标仪在490nm波长下测定吸光度。

从甲状软骨处剪断气管，分离肺组织，用2mL PBS液冲洗肺，反复3次，收集肺泡灌洗液(BALF)约6mL，1000r/min离心15min，上清移出，沉淀重新溶于50μL PBS液中，进行白细胞计数，涂片，瑞氏吉姆萨染色，计算EOS比率。剪下双耳，左右耳相同部位用8mm打孔器取耳片，称重，以左右耳重之差计算迟发性超敏反应值。肺右下叶于Bouin氏液(饱和苦味酸∶100mL/L甲醛∶冰醋酸为15∶5∶1)中固定；叶支气管于100mL/L甲醛中固定。石蜡包埋、切片、HE染色，做病理观察[5]。

取出肺组织后分离支气管，切成2mm长的圆桶段，在显微镜下，将支气管环套在器官浴槽中的两个L型钢针上，其中一针连接张力换能器，另一针连接微调装置，调节负荷张力2mN，平衡稳定2h后，用高K+液检验收缩活性，两次收缩均超过1mN且收缩幅度相差<10%的用于实验[6]。用5HT(10-5mol/L)预收缩支气管，平衡后按累加浓度法加入IP(10-11～10-5mol/L)，获得剂量舒张曲线，考察β受体的舒张功能[7]；累加浓度法加入ACh(10-9～10-3mol/L)、5HT(10-9～10-5mol/L)、S6c(10-10～3×10-8mol/L)和ET1(10-10mol/L)，获得剂量收缩曲线，考察各收缩剂相应受体的功能。

　　1.5 统计处理

　　数据用均数±标准差表示；采用单因素方差分析和两两对比的t检验进行统计学检验，显著性水平P<0.05；图表绘制应用Prism 4.0软件；收缩力表示为药物诱发的收缩相对于45mmoL/L K+产生收缩效应的百分比；舒张率表示为药物诱发的舒张力相对于预收缩剂产生收缩效应的百分比。

　　2 结果

　　2.1 肺指数

　　大鼠处死后从甲状软骨处剪断气管，分离肺组织，称重，计算肺指数(肺指数=肺重量/体重×100%)。结果显示，5种品系哮喘模型大鼠的肺指数与其对照组相比，均无显著性差异(表1)。表1 DA、 DA.1u、E3、DE和SD哮喘大鼠的肺指数和耳肿胀（略）

　　2.2 迟发性超敏反应

　　表1结果显示，E3、DE和SD大鼠模型组耳廓肿胀度均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)；DA和DA.1u大鼠模型组耳廓肿胀度与对照组相比有增高趋势，但无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 肺泡灌洗液中的白细胞数与嗜酸细胞比率

　　结果显示，DA、DA.1u、E3和SD 4种品系大鼠造模后白细胞数有增加趋势，但无统计学意义(P>0.05)。4种大鼠品系中E3哮喘大鼠模型的嗜酸细胞比率显著高于对照组(P<0.01)；DA、DA.1u和SD大鼠模型组和对照组嗜酸细胞比率无明显变化(P>0.05，表2)。表2 不同种属哮喘大鼠肺泡灌洗液中白细胞与嗜酸细胞比率（略）

　　2.4 血清中NO和IgE的含量

　　Griess法测定血清中NO含量[8]。表3结果显示，DA、DA.1u、E3和SD大鼠哮喘模型组血清中NO含量与相应对照组相比均无显著性差异。ELISA法测定血清中IgE的含量，结果显示，E3哮喘大鼠血清中IgE与对照组相比有所增高(P<0.05)。DA、DA.1u和SD大鼠模型组IgE与各自对照组比较无显著性差异(P>0.05)。

　　2.5 病理学检查

　　结果显示，E3大鼠肺组织病理切片可见气道平滑肌增厚、气道上皮严重损伤、炎性细胞增多、大量嗜酸性粒细胞浸润和支气管内黏液；SD大鼠病理切片可见气道平滑肌增厚、气道上皮严重损伤、炎性细胞增多和支气管内黏液，但少见嗜酸性粒细胞浸润；DA、DA.1u大鼠见少数支气管内有黏液，未见其他病变；DE病理切片有支气管内有黏液、气道上皮部分脱落、炎性细胞增多现象，但未见气道平滑肌增厚、嗜酸性粒细胞浸润。表3 DA， DA.1u， E3和SD哮喘大鼠血清NO和IgE含量（略）

　　2.6 支气管舒缩功能[910]

　　5种品系大鼠的叶支气管，以5HT(1×10-5mol/L)预收缩，稳定后加入10-5mol/L IP，观察各品系大鼠β受体介导的支气管舒张作用，结果以IP诱导的舒张相对于5HT收缩效应的百分比表示，结果显示，5种哮喘大鼠IP诱导的最大舒张(Rmax)分别与对应品系正常对照组相比均有下降趋势，但仅E3大鼠有显著性差异(P<0.01)。5种品系大鼠的叶支气管加入3×10-8mol/L S6c，观察ETB受体介导的收缩，其最大收缩Emax表示为45mmoL/L K+产生收缩效应的百分比。结果显示，5种哮喘大鼠S6c诱导收缩的Emax与对应的正常对照组相比均有上升趋势，仅E3和SD大鼠有显著性差异(P<0.01)。提示卵蛋白所致的E3大鼠哮喘模型的β受体、ETB受体功能改变比较明显(表4)。表4 异丙肾上腺素在不同种属哮喘大鼠支气管介导的舒张作用和S6c介导的收缩作用（略）

　　3 讨论

制备哮喘模型的常用动物各具特点，国内制备哮喘模型的动物中豚鼠最常见。豚鼠易致敏，接受致敏物质后反应程度比较强，能产生I型变态反应。但豚鼠的过敏反应差异较大，且其变态反应更多由IgG而非IgE介导，这与人类的有所不同[11]。小鼠哮喘模型以其免疫、遗传背景较为清楚，成本低，免疫学及分子生物学试剂来源广，得到较大发展。小鼠激发后血清IgE升高，肺血管周围及支气管周围有嗜酸细胞浸润，支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸细胞明显增加，气道反应性增加。但其也有许多局限性[12]：首先，不出现人类哮喘特征性的黏膜炎症及上皮层嗜酸性细胞浸润；第二，不出现人类哮喘典型的慢性气道炎症和上皮变化；第三，大多数模型出现过敏性肺泡炎和超敏性肺炎，掩盖了气道的炎症损害；第四，气道狭小，肺和支气管功能测定技术难度大。猫、兔、羊、犬及灵长类等也可用于制作哮喘模型，但同样不满意，因为它们并不能自发哮喘，加之价格昂贵限制了其应用。

大鼠具有品系纯、标本采集量大、对抗原反应较一致、能诱发出与人类哮喘相似的迟发相反应等特点[5，78]。近年大鼠哮喘模型使用逐渐增多，但我国常用的SD、Wistar大鼠均不适宜用于哮喘研究。本实验室从瑞典引进DA、DA.1u、E3大鼠，并成功杂交出DA×E3第1代DE大鼠。我们以卵蛋白为变应原，以氢氧化铝为佐剂腹腔注射免疫，14d后卵蛋白滴鼻攻击7次，制备了DA、DA.1u、E3、DE和SD大鼠哮喘模型，并对这5个不同品系的大鼠哮喘模型进行了比较。结果显示，E3大鼠哮喘模型嗜酸性粒细胞浸润增加，肺组织病理切片中可见气道平滑肌增厚、气道上皮损伤严重、炎性细胞增多及支气管内黏液，血清中IgE含量升高，有明显的迟发性超敏反应；而SD大鼠病理切片中有气道平滑肌增厚、气道上皮损伤严重、炎性细胞增多和支气管内黏液的炎症改变，有明显的迟发超敏反应，但未见嗜酸性粒细胞浸润和血清中IgE含量改变；DA、DA.1u哮喘模型未见病变；而DE大鼠介于E3和DA大鼠之间，其病变与SD大鼠有相似之处，但比SD大鼠弱。E3大鼠哮喘模型能很好地模拟人类哮喘的病理生理改变，而SD大鼠哮喘模型只能体现人类哮喘的个别病变。因此，以E3大鼠为对象研究哮喘、建立新的评价方法更合理。

实验中发现，β受体在哮喘模型鼠舒张功能降低，敏感性减弱，ETB受体收缩功能增加，与文献结果一致[1314]。我们也发现M受体造模前后其收缩功能没有明显改变，5HT受体在造模后收缩功能降低，未见组胺引起大鼠支气管平滑肌收缩，但组胺在豚鼠哮喘模型中所介导的收缩是增强的(另文报道)。动物种属间差异很大，这就导致不同种属对组胺的反应差异很大。

我们引进了新的大鼠品系，建立了与人类哮喘病变相似的哮喘动物模型，同时建立了以支气管平滑肌受体功能评价哮喘的新方法，为探讨哮喘的发病机制、筛选治疗药物提供了新的途径；并且我们发现E3大鼠对卵蛋白所致哮喘敏感，而DA大鼠不敏感，这为哮喘的病因研究、药物评价提供了新方法。

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