人乳腺癌组织中Wnt/βcatenin信号传导通路的异常表达与Her2阳性表达间的关系

　　　　 作者：王珂，任予，何建军，张云锋，陈武科，马清涌

【摘要】 　　目的 观察人乳腺癌组织中Wnt/βcatenin信号传导通路主要组分Ecadherin、βcatenin、Cyclin D1的异常表达及其关键组分βcatenin的异常表达与Her2阳性表达之间的关系。方法 采用免疫组织化学Elivision两步法检测了90例人乳腺癌组织中Her2、Ecadherin、βcatenin以及Cyclin D1的表达情况。结果 Ecadherin表达正常组中βcatenin的异常表达率(27.3%)显著低于Ecadherin表达缺失组(75.0%)；βcatenin异常表达组中Cyclin D1过表达率(83.3%)显著高于βcatenin正常组(40.7%)。Her2阳性组中βcatenin的异常表达率(73.5%)明显高于Her2阴性组(19.6%)。当Her2的阳性表达与βcatenin的异常表达同时存在时腋窝淋巴结转移的阳性率较高。结论 在一些人乳腺癌组织中存在Wnt/βcatenin信号传导通路的异常表达，并且其异常表达与Her2的阳性表达有关，二者的异常表达能够协同促进乳腺癌细胞的淋巴结转移。

【关键词】 人乳腺癌；Her2；Wnt信号传导通路；Ecadherin；βcatenin；Cyclin D1

　: Objective To investigate ectopic expression of key elements of Wnt/βcatenin signaling pathway， including Ecadherin， βcatenin and Cyclin D1， as well as the relationship between ectopic expression of βcatenin and overexpression of Her2 in human breast carcinoma tissues. Methods Immunohistochemical technique (Elivision) was used to detect the expression of Her2 and three elements of Wnt/βcatenin signaling pathway (βcatenin， Ecadherin， Cyclin D1) in 90 samples of human breast carcinoma. Results In Ecadherin normallyexpressed group， the ectopic expression rate of βcatenin (27.3%) was significantly lower than that (75.0%) in Ecadherin negative breast carcinoma; in βcatenin ectopic expression group， overexpression rate of Cyclin D1 (83.3%) was significantly higher than that (40.7%) in the other group. In Her2 overexpressedbreast carcinoma tissue， the ectopic expression rate of βcatenin (73.5%) was significantly higher than that (19.6%) in Her2 negative breast carcinoma. Her2 overexpression could coexist with ectopic expression of Wnt/βcatenin in promoting axillary lymph node metastasis in human breast carcinoma. Conclusion Ectopic expression of Wnt/βcatenin signaling pathway does exist in some human breast carcinoma tissues， and the abnormal expression correlates with overexpression of Her2. Furthermore， the instantaneous activation of them could present synergism in promoting metastasis of axillary lymph nodes.

　　KEY WORDS: human breast carcinoma; Her2; Wnt signaling pathway; Ecadherin; βcatenin; Cyclin D1

　　人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2， Her2)属于表皮生长因子受体(EGF)酪氨酸激酶家族的成员之一。目前，国内外多数的研究表明在20%～30%的人类乳腺癌中存在Her2阳性表达，并且Her2的阳性表达多与淋巴结转移、较大的肿瘤直径、较高的恶性程度、低表达的雌、孕激素受体状态、绝经后状态以及较短的总生存期和无病生存期显著相关。研究表明Her2的过表达可以异常激活多条信号传导通路从而导致肿瘤细胞的过度增殖和侵袭，其中包括PI3K和MAPK等[12]。本实验前期研究使用Geldanamycin体外干预Her2高表达的人乳腺癌细胞系SKBr3，证实Her2的过表达可异常激活Wnt/βcatenin信号传导通路，促进SKBr3细胞的增殖和侵袭[3]。本研究拟观察人乳腺癌组织中Wnt/βcatenin信号传导通路主要组分Ecadherin、βcatenin和CyclinD1的异常表达及关键组分βcatenin的异常表达与Her2过表达之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　随机抽取90例于2004年6月～2005年6月间在西安交通大学医学院第一附属医院接受手术治疗的乳腺癌病例。所有患者均为女性，年龄21～71岁，平均年龄(50.5±10.8)岁，术前均未行辅助性的放化疗。术后病理确诊为乳腺癌，肿瘤病理类型及腋窝淋巴结转移情况根据本院病理科的术后病理报告确定。

　　1.2 主要试剂

　　鼠抗人Her2单克隆抗体、鼠抗人βcatenin单克隆抗体、兔抗人Cyclin D1单克隆抗体、鼠抗人Ecadherin单克隆抗体以及ElivisionTM Plus试剂盒均购自福州迈新生物工程有限公司。

　　1.3 方法

　　采用免疫组化Elivision两步法，抗原修复均采用微波法，以0.01mol/L PBS液代替一抗作阴性对照，以已知Her2、Ecadherin、βcatenin及CyclinD1蛋白阳性表达的乳腺癌组织作阳性对照。

　　1.4 统计学方法

　　应用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 乳腺癌患者Her2、βcatenin、Cyclin D1及Ecadherin的表达
　　Her2阳性为癌细胞膜出现棕黄色颗粒。根据肿瘤细胞的阳性数进行判定，即用高倍视野随机计数500个肿瘤细胞，计算阳性细胞的百分数。阳性细胞数<10%为阴性、>10%的为阳性(图1)。

　　βcatenin阳性染色为棕黄色颗粒状染色，分别从细胞膜、细胞质、细胞核判断βcatenin在癌细胞内的分布，即膜阳性细胞率>70%为正常表达，反之为表达减弱或缺失；胞质或胞核阳性细胞率>10%为异位表达，膜表达减弱或缺失及异位表达均称为异常表达(图2)。

Cyclin D1阳性表达定位于细胞核，呈棕黄色细小颗粒着色为阳性细胞。在高倍显微镜下计数500个以上癌细胞，计算细胞的阳性率，细胞阳性率>10%为过度表达(图3)。

Ecadherin阳性表达主要定位于细胞膜，呈棕黄色颗粒着色。高倍显微镜下计数500个以上癌细胞，计算细胞的阳性率，细胞阳性率>75%为表达正常，细胞阳性率<75%为表达缺失(图4)。

　　90例人乳腺癌组织标本中，Her2总阳性表达率为37.8%(34/90)，βcatenin的异常表达率为40%(36/90)，Cyclin D1的过度表达率为57.8%(52/90)，Ecadherin的表达缺失率为26.7%(24/90)(表1)。表1 乳腺癌患者Her2、βcatenin、Cyclin D1及Ecadherin表达情况（略）

　　2.2 Wnt/βcatenin信号传导通路主要组分Ecadherin、βcatenin、Cyclin D1异常表达之间的关系

　　2.2.1 Ecadherin的缺失表达与βcatenin的异常表达
　　
　　Ecadherin总表达缺失率为26.7%(24/90)，在Ecadherin表达正常组中βcatenin的异常表达率仅为27.3%(18/66)，显著低于Ecadherin表达缺失组中的75.0%(18/24)，两者比较有非常显著性差异(χ2＝16.7，P<0.01，表2)。表2 Ecadherin缺失表达与βcatenin异常表达间的关系（略）

　　2.2.2 Cyclin D1的过表达与βcatenin的异常表达

　　Cyclin D1总过度表达率为57.8%(52/90)，βcatenin异常表达组中Cyclin D1过表达的阳性率为83.3%(30/36)，显著高于βcatenin正常组中的40.7%(22/54)(χ2＝16.1，P<0.01，表3)。表3 Cyclin D1过表达与βcatenin异常表达间的关系（略）

　　2.3 Her2阳性表达与βcatenin异常表达间的关系

　　βcatenin总异常表达率为40%(36/90)，而在Her2阳性组中βcatenin的异常表达率高达73.5%(25/34)，在Her2阴性组中βcatenin的异常表达率仅为19.6%(11/56)，二者之间的差异非常显著(χ2＝25.6，P<0.01)。Her2阳性组中βcatenin的异常表达率明显高于Her2阴性组(表4)。表4 Her2阳性表达与βcatenin异常表达间的关系（略）

　　2.4 Her2、βcatenin、Cyclin D1及Ecadherin表达与腋窝淋巴结转移的关系

　　在腋窝淋巴结转移阳性组中Her2的阳性表达率、βcatenin的异常表达率、Cyclin D1的过表达率以及Ecadherin的表达缺失率均显著高于腋窝淋巴结转移阴性组(表5)。表5 Her2、βcatenin、Cyclin D1及Ecadherin的表达与腋窝淋巴结转移的关系（略）

　　2.5 Her2阳性表达与βcatenin异常表达的联合检测与淋巴结转移的关系
　　90例人乳腺癌组织中腋窝淋巴结转移的阳性率为57.8%，当Her2的阳性表达与βcatenin的异常表达同时存在时，腋窝淋巴结转移的阳性率高达80.0%，显著高于二者之一单独异常表达以及二者均正常表达时的腋窝淋巴结转移率(χ2＝8.9，P<0.05，表6)。表6 Her2与βcatenin表达的联合检测与淋巴结转移的关系（略）

　　3 讨 论

Her2癌基因过度表达预示乳腺癌的预后差，目前已证实25%～30%的乳腺癌患者肿瘤中存在Her2的过表达，这类患者肿瘤易发生早期复发且患者生存期缩短[4]。在前期的研究中我们已经发现Geldanamycin能够通过降解Her2破坏Her2对βcatenin的磷酸化作用，逆转了Wnt/βcatenin信号通路的异常激活效应，从而抑制了Her2高表达人乳腺癌细胞系SKBr3的增殖和迁移能力。

βcatenin是Wnt/βcatenin信号通路中关键的细胞内信号传导分子，在正常情况下βcatenin与Ecadherin形成粘附复合体在细胞膜表面介导同种细胞之间的粘附作用，而当Wnt/βcatenin信号通路被异常激活时，βcatenin从细胞膜的定位中脱离出来，在细胞浆中稳定地聚集，并进一步被转运至细胞核中，通过与转运因子T细胞因子(TCF)、淋巴细胞增强因子(LEF)以及协同激活因子相结合激活多种靶基因的转录，其中最重要的靶基因就是Cyclin D1[5]。一方面Cyclin D1过表达可以促进肿瘤细胞周期的进展导致细胞过度增殖，另一方面，βcatenin从Ecadherin/βcatenin粘附复合体中的脱离使该粘附复合体丧失了介导同种细胞之间的粘附作用，使肿瘤细胞更容易从原发灶中脱离出来而进入周围组织中进行侵袭。而如果存在Ecadherin的表达缺失，则βcatenin更容易从正常的细胞膜定位中脱离出来进入细胞质中，起到异常激活Wnt/βcatenin信号通路的作用。本研究结果符合这一机制：Ecadherin表达正常组中βcatenin的异常表达率(27.3%)显著低于Ecadherin表达缺失组(75.0%)；βcatenin异常表达组中Cyclin D1过表达率(83.3%)显著高于βcatenin正常组(40.7%)。

在本研究中Her2的阳性表达率为37.8%，与文献报道的基本一致，而βcatenin在乳腺癌组织中的异常表达率为40.0%，也与国外学者的研究结果基本相同[6]，并且Her2阳性组中βcatenin的异常表达率明显高于Her2阴性组。国外学者的研究表明在MMTVWnt1和MMTVcNeu转基因小鼠中，Her2/Neu蛋白酪氨酸激酶能够磷酸化βcatenin羧基末端654位的酪氨酸，从而使βcatenin丧失正常的维持细胞粘附性的功能而异常激活Wnt/βcatenin信号传导过程，促进了乳腺癌的发生[7]。而在人类乳腺癌中，有关Her2与Wnt/βcatenin信号通路间作用机制的研究较少，也无明确的结论。本结果提示在人乳腺癌组织中可能确实存在Her2与βcatenin之间的相互作用。

虽然βcatenin的异常定位与Wnt/βcatenin信号传导通路的异常激活间有着非常密切的关系，但也不是单单βcatenin的异常定位就能代表Wnt/βcatenin信号传导通路的异常激活，如果存在该信号传导通路的异常激活，就必然存在其上游调控分子及其下游靶基因的一系列变化。我们通过分析Ecadherin缺失表达与βcatenin异常表达之间的关系发现，在Ecadherin缺失表达组中βcatenin的异常表达率明显升高，而在正常情况下βcatenin是与Ecadherin形成粘附复合体而在细胞膜表面介导同种细胞之间的粘附作用，因此当Ecadherin表达缺失时，βcatenin更容易出现异位表达，同时Ecadherin/βcatenin粘附复合体的崩解使该粘附复合体丧失了介导同种细胞之间的粘附作用，使肿瘤细胞更容易从原发灶中脱离出来而进入周围组织中进行侵袭。这正符合我们在腋窝淋巴结转移方面的观察结果：Her2的阳性表达、βcatenin的异常定位以及Ecadherin的缺失表达均有可能与乳腺癌的腋窝淋巴结转移过程有关，并且当Her2的阳性表达与βcatenin的异常表达同时存在时腋窝淋巴结转移的机率更高。

细胞信号传导通路的激活之所以能够促进细胞的过度增殖，主要是因为激活了特定靶基因的转录，而Cyclin D1正是Wnt/βcatenin信号传导通路非常重要的靶基因之一。通过分析Cyclin D1的过表达与βcatenin异常表达之间的关系，我们发现βcatenin异常表达组中Cyclin D1过表达的阳性率显著高于βcatenin正常组，这就说明人乳腺癌中Cyclin D1过表达的原因之一可能就是由Wnt/βcatenin信号传导通路的异常激活所致，杨剑锋[8]等研究了60例人乳腺癌组织中Ecadherin、βcatenin以及Cyclin D1的表达情况得出了与我们相似的结论。而Cyclin D1的过表达与淋巴结转移的关系也证实了以往的研究[9]，但其具体的机制尚不清楚，我们的研究提示其中可能与Wnt/βcatenin信号传导通路的异常激活有着一定的关系。

综上所述，本研究提示在人乳腺癌组织中存在有Wnt/βcatenin信号传导通路的异常表达，并且其异常表达与Her2的阳性表达有关，二者的异常表达能够协同促进乳腺癌细胞的淋巴结转移。

参考文献

　　[1]PELES E， LAMPRECHT R， BEN LR， et al. Regulated coupling of the Neu receptor to phosphatidylinositol 3kinase and its release by oncogenic activation [J]. J Biol Chem， 1992， 267(17):1226612274.

　　[2]BEN LR， PATERSON HF， MARSHALL CJ， et al. A single autophosphorylation site confers oncogenicity to the Neu/ErbB2 receptor and enables coupling to the MAP kinase pathway [J]. EMBO， 1994， 13(14):33023311.

　　[3]WANG K， MA QY， REN Y， et al. Geldanamycin destablizes HER2 tyrosine kinase and suppresses Wnt/βCatenin signaling in HER2 overexpressing human breast cancer cells [J]. Oncology Reports， 2007， 17(1):8997.

　　[4]HAYES DF， THOR AD. CerbB2 in breast cancer development of a clinically useful marker [J]. Semin Oncol， 2002， 29(3):231245.

　　[5]BRENNAN KR， BROWN AM. Wnt proteins in mammary development and cancer [J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia， 2004， 9(2):119131.

　　[6]JONSSON M， BORG A， NILBERT M， et al. Involvement of adenomatous polyposis coli (APC)/betacatenin signaling in human breast cancer [J]. Euro J Cancer， 2000， 36(2):242248.

　　[7]BONVINI P， WON GA， ROSOLEN A， et al. Geldanamycin abrogates ErbB2 association with proteasomeresistant βCatenin in melanoma cells， increases βCateninECadherin association， and decreases βCateninsensitive transcription [J]. Cancer Res， 2001， 61(4):16711677.

　　[8]杨剑锋，陈森林，刘志红，等. 乳腺癌组织中Ecadherin、βcatenin及Cyclin D1表达的相关性研究 [J]. 癌症， 2004， 23(7):799802.

　　[9]SCHUNRING E， VERHOEVEN E， VAN TINTEREN H， et al. Amplification of gene within the chromosome 11q13 region is indicative of poor prognosis in patient with operable breast cancer [J]. Cancer Res， 1992， 52(19):52295234.