川芎嗪对脑缺血后不同脑区神经元型NO合酶表达的影响

　　　　　　作者：邱芬，刘勇，马波，祁存芳，王文静

【摘要】 　　目的 通过观察脑缺血后不同时间、不同脑区神经元型NO合酶(nNOS)的表达，探讨川芎嗪对脑缺血后nNOS表达的影响。方法 成年雄性SD大鼠，随机分为假手术组、缺血模型组及川芎嗪低(20mg/kg)、中(40mg/kg)、高(80mg/kg)剂量组5组，每组按缺血后时间又分为1、3、7、14、21d 5个亚组。线栓法制作左侧大脑中动脉阻塞模型，术后2h腹腔注射不同剂量的川芎嗪(1次/d)，至处死前2h。免疫组化染色观察脑缺血后不同时间侧脑室室下区(SVZ)、胼胝体(CC)、梗塞区周围纹状体和大脑皮质、海马CA1区及齿状回(DG) nNOS表达。结果 假手术组各脑区不同时间nNOS的表达相近，差异均无统计学意义(P>0.05)。在SVZ，模型组1～14d nNOS表达降低，21d 时增高；川芎嗪各剂量组均表现为3～14d nNOS表达明显降低，21d明显增高。在CC，模型组3～14d明显降低，21d有所回升；芎嗪各剂量组nNOS表达均表现为3～14d明显降低，以中、高剂量组降低最为明显，21d增高。在缺血周围皮质和纹状体，模型组nNOS表达均表现为3、7d明显降低，14、21d呈明显增加趋势；川芎嗪各剂量组nNOS的表达3～21d均较低，以中、高剂量组7～14d降低最为明显，21d时稍有回升。在DG、CA1区，模型组3、7d nNOS表达明显降低，14d时增高；川芎嗪各剂量组3～21d nNOS的表达均降低。各脑区不同时间点nNOS表达模型组与川芎嗪各组间均存在明显差异(P<0.05)。结论 川芎嗪对脑缺血后3～14d各脑区nNOS的表达有明显抑制作用，提示川芎嗪可能通过抑制nNOS的表达、减少NO产生发挥其脑保护作用。

【关键词】 川芎嗪；脑缺血；神经元型一氧化氮合酶；室下区；胼胝体；纹状体；齿状回
　　
　　ABSTRACT: Objective To observe the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in different encephalic regions and at different time points after focal cerebral ischemia in adult rats and explore the effect of Ligustrazine on nNOS expression. Methods SD male adult rats were randomly pided into five groups: sham operation， ischemic model， low dose (20mg/kg)， medium dose (40mg/kg) and high dose (80mg/kg) Ligustrazine groups. According to the time after ischemia， each group was further pided into 5 subgroups: 1， 3， 7， 14， and 21d (3 rats in each subgroup). Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established by placement of an intraluminal filament at the origin of MCA. Ligustrazine was administered intraperitoneally at a daily dose of 20， 40 or 80mg/kg starting at 2h after MCAO， respectively， until 2h before sacrifice. Immunohistochemical staining was adopted to observe nNOS expression in subventricular zone (SVZ) of the lateral cerebral ventricle， corpus callosum (CC)， striatum and cortex periinfarction， CA1 area， and dentate gyrus (DG). Results Expression of nNOS at different time points was similar in sham operation group， with no significant difference (P>0.05). In SVZ， nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 1-14， but increased on day 21; after Ligustrazine administration， nNOS expression was obviously decreased on days 3-14 in all Ligustrazine dose groups， but began to　increase on day 21. In CC， nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 3-14， and began to increase on day 21; in the differentdose Ligustrazine groups， nNOS expression was significantly decreased on days 3-14， especially in medium and highdose groups， but increased on day 21. In striatum and cortex periinfarction， nNOS expression in ischemic model group was obviously decreased on days 3 and 7， but enhanced on days 14 and 21; in variousdose Ligustrazine groups， nNOS expression was decreased on days 3-21， especially in medium and highdose groups， but increased slightly on day 21. In DG and CA1 areas， nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 3 and 7， but began to increase on day 14; nNOS expression in all Ligustrazine groups were decreased during 3-21d. There were significant differences between ischemic model group and differentdose Ligustrazine groups at different time points (P<0.05). Conclusion Ligustrazine has a significantly inhibitory effect on nNOS expression in different encephalic regions during 3-14d after focal cerebral ischemia， suggesting that Ligustrazine might play a brainprotecting role by inhibiting nNOS expression and reducing NO production.

　　KEY WORDS: Ligustrazine; cerebral ischemia; neuron NO synthase; subventricular zone (SVZ); corpus callosum (CC); striatum; dentate gyrus (DG)

　　在中枢神经系统中，一氧化氮(NO)是一个具有信号传递功能的自由基分子，脑实质内的NO由广泛分布、表达神经元型NO合酶(neuronal nitric oxide synthase， nNOS)的特定神经元合成。胚胎发育期间，室下区nNOS的表达增加，室下区内或附近的迁移细胞表达nNOS，处于皮质神经发生高峰期的大脑皮质板和海马内，NOS活性的暂短升高与干细胞增殖的停滞和细胞分化的时间一致，提示NO在胚胎期的神经发生中起一定作用[12]。中枢神经系统形成时，NO的参与可能与神经元的程序性细胞死亡、轴突投射模式的形成、细胞增殖的控制、迁移和分化的调节有关。NO在个体发育的不同阶段和不同的脑区以及不同的生理病理状态下所产生的作用并不相同[35]。有研究显示，nNOS在脑缺血后侧脑室室下区(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回颗粒下层(subgranular zone， SGZ)区的细胞增殖、迁移和分化中发挥一定的作用。

　　川芎嗪(Ligustrazine， Lig)在临床上用于治疗脑梗塞疗效肯定。研究表明川芎嗪能降低脑缺血再灌注后NOS活性，对脑缺血可能产生保护作用。我们以前的研究表明，川芎嗪能促进脑缺血诱导的SVZ和SGZ内细胞的增殖和迁移[68]，其机制尚不清楚。为了探讨川芎嗪的作用机制，我们观察了川芎嗪对脑缺血后不同时间侧脑室室下区SVZ、胼胝体(corpus callosum， CC)、梗塞区周围纹状体和大脑皮质、海马CA1区、齿状回 (dentate gyrus， DG) nNOS表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　成年雄性SD大鼠，体重220～260g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。适应性饲养1周后进行实验。

　　1.1.2 仪器和试剂

　　冰冻切片机(HM505 E， Zeiss， Germany)；图像分析仪(Q550CW， 德国莱卡公司)。兔多克隆抗nNOS抗体(1∶200)、山羊抗兔IgG (即用型)和SABC复合液(即用型)均购自北京中山生物技术有限公司；DAB(博士德生物工程有限公司)；盐酸川芎嗪注射液(无锡第七制药有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组

　　SD大鼠随机分为假手术组、缺血模型组及川芎嗪低、中、高剂量组5组，每组按缺血后时间分为1、3、7、14、21d 5个亚组，每组3只大鼠。

　　1.2.2 局灶性脑缺血模型的制作

　　采用线栓法制作左侧大脑中动脉阻塞模型[9]。假手术组除不插入栓线外，其余操作步骤同缺血模型组。川芎嗪低、中、高剂量组术后2h分别腹腔注射盐酸川芎嗪注射液20、40、80mg/kg，1次/d，直至处死前2h。假手术组、缺血模型组腹腔注射等量的生理盐水。

　　1.2.3 缺血损伤的判定

　　在大鼠大脑中动脉阻塞后2h，参照改良的Bedersons评分方法[9]进行神经功能缺失评分。选择评分大于2分者进行下一步实验。

　　1.2.4 nNOS免疫组织化学染色

　　分别取各组脑缺血后1、3、7、14、21d一套切片行nNOS免疫组织化学染色。主要步骤如下：①切片经充分漂洗后，加入10mL/L h3O2，室温30min；②10mL/L Triton X100，室温30min；③加入山羊血清封闭内源性过氧化物酶，室温30min；④加兔多克隆抗nNOS抗体(1∶200)，4℃冰箱过夜；⑤Biotin标记的山羊抗兔IgG，室温2h；⑥滴加SABC复合液，室温1h。上述各步骤之间均用0.01mol/L PBS(pH 7.4)充分漂洗3次，每次5min。DAB显色。漂洗切片，晾干、脱水、透明、封片。阴性对照除不加入兔多克隆抗nNOS抗体外，其余步骤同上。

　　1.2.5 nNOS免疫组织化学染色阳性面积的测定

　　在各观察点上，每组取3只大鼠，每只大鼠取3张切片，间隔200μm，在高倍镜下随机选取3个视野，应用Motic Images Advances 3.2图像分析软件，测定各脑区nNOS阳性染色面积占选区面积的百分比。假手术组大鼠检测左侧半球各脑区内nNOS的阳性表达面积占选区面积的百分比。

　　1.2.6 统计学分析

　　数据资料使用SPSS11.5统计软件分析。数据用均数±标准差(±s)表示，采用多因素方差分析，组间比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 nNOS在各脑区的分布

　　假手术组nNOS阳性细胞主要分布于CA1区、DG、SVZ、纹状体、皮质、基底前脑和胼胝体。在CA1区nNOS阳性细胞散在分布于锥体细胞层，突起并不长(图1A)；DG nNOS阳性细胞分别位于颗粒细胞层、颗粒下层及门区，以颗粒细胞下层偏多(图1B)；SVZ区的nNOS阳性细胞胞体位于SVZ外，其长的突起并不穿越SVZ和室管膜层(图1C)；纹状体nNOS阳性细胞较多，并发出长的突起连接成网(图1D)；皮质nNOS阳性细胞相对较少，散在分布，发出长的突起(图1E)；基底前脑分布较多nNOS阳性细胞，但突起较短(图1F)；胼胝体的nNOS阳性细胞散在分布，可见胞体及突起(图1G)。

　　2.2 各组脑缺血后SVZ nNOS的表达

　　脑缺血后nNOS阳性细胞的胞体位于SVZ外，其长的突起并不穿越SVZ和室管膜层，类似于假手术组。假手术组1～21d nNOS的表达相近，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组1～14d SVZ nNOS表达降低，21d增高，1、3、7、14d比较均无统计学差异(P>0.05)，与21d比较均有统计学差异(P<0.05)；模型组1～14d与假手术组同一时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)，21d时两组无统计学差异(P>0.05)。川芎嗪低剂量组3～14d nNOS的表达明显降低，21d明显增高，与1、7、14d比较均有统计学差异；川芎嗪中、高剂量组1～21d nNOS的表达趋势同低剂量组，川芎嗪低、中剂量组各时间点比较均无统计学差异(P>0.05)，只是高剂量组7d时表达更低，21d仍维持较低水平；川芎嗪各剂量组与模型组同一时间点比较均有统计学差异 (P<0.05，图2)。

　　2.3 各组脑缺血后胼胝体nNOS的表达

　　在模型组和川芎嗪各剂量组，nNOS阳性细胞的分布与假手术组相似，在胼胝体区可见散在nNOS阳性细胞胞体及有些细胞发出长的突起。假手术组1～21d胼胝体nNOS的表达相似，各时间点比较均无统计学差异(P>0.05)。模型组3d开始nNOS的表达减少，14d达最低，21d有所回升；7、14d分别与1、3、21d比较均有统计学差异(P<0.05)，除21d外，与假手术组同一时间点比较均有统计学差异(P<0.05)。川芎嗪各剂量组nNOS的表达均表现为3～14d明显减少，以中、高剂量组减少最为明显，21d增高，与假手术组、模型组同一时间点比较均有统计学差异(P<0.05，图3)。

　　2.4 各组脑缺血后梗塞区周围皮质和纹状体nNOS的表达

　　假手术组1～21d皮质和纹状体 nNOS的表达相似，各时间点比较均无统计学差异(P>0.05)。模型组梗塞区周围皮质和纹状体nNOS的表达均表现为3、7d明显减少，14、21d呈明显增加趋势，3、7d分别与1、14、21d比较均有统计学差异(P<0.05)，与假手术组同一时间点比较亦均有统计学差异(P<0.05)。川芎嗪各剂量组nNOS的表达3～21d均较低，以中、高剂量组7～14d降低最为明显，21d稍有回升；除3d外，低剂量组与中、高剂量组同一时间点比较均有差异(P<0.05)，而中、高剂量组各时间点比较均无统计学差异(P>0.05)；与假手术组比较均有统计学差异(P<0.05)；除1d外，与模型组同一时间点比较均有统计学差异(P<0.05，图4、图5)。

　　2.5 各组脑缺血后DG和CA1区nNOS的表达

　　假手术组DG 1～21d nNOS表达相似，均无统计学差异(P>0.05)。模型组DG 3d始nNOS表达降低，7d达最低，14d时增高，1、3、7d分别与14、21d比较均有统计学差异(P<0.05)，14d与21d比较无统计学差异(P>0.05)，但与假手术组同一时间点比较均有统计学差异(P<0.05)。川芎嗪各剂量组3～21d DG nNOS表达降低，以7、14d降低最明显；川芎嗪中、高剂量组除7、21d无差异外，余时间点比较均有统计学差异(P<0.05)，而川芎嗪低、中剂量组比较3、7、14d均无统计学差异(P>0.05)；与假手术组、模型组同一时间点比较均有统计学差异(P<0.05，图6)。

　　假手术组1～21d CA1区 nNOS表达相似，均无差异(P>0.05)。模型组3、7d CA1区 nNOS表达降低，14d增加，3、7d分别与1、14、21d比较均有统计学差异(P<0.05)，与假手术组同一时间点比较亦均有统计学差异(P<0.05)。川芎嗪各剂量组3～21d CA1 nNOS表达降低，以7、14d最明显，各剂量组相比较均无统计学差异(P>0.05)，但与假手术组、模型组在同一时间点比较均有统计学差异(P<0.05，图7)。

　　3 讨论

　　3.1 脑缺血后SVZ细胞增殖与nNOS的表达的关系及川芎嗪的作用

　　nNOS是哺乳动物脑内NOS的主要异构体。MORENOLOPEZ等[10]研究发现，在SVZ硝基能神经元与神经前体细胞紧密缠结，这为NO在成体神经发生中的调节作用提供了形态学基础。MATARREDONA 等[1]体外研究NO对出生后小鼠SVZ神经前体细胞增殖的作用，结果发现nNOS抑制剂(LNAME)能增加BrdU阳性细胞比例，而NO供体则使细胞增殖降低，表明NO负性调节SVZ神经前体细胞的增殖。PACKER等[11]研究亦显示，NO负性调节成年大鼠脑内神经干细胞的增殖，而且这一作用是由于影响细胞有丝分裂而并非程序性死亡。张蓬勃等[12]研究发现，局灶性脑缺血后，室管膜/室下区区域nNOS表达降低的时间与室管膜细胞增殖的时间相一致，而室管膜/室下区缺乏nNOS阳性表达的胞体和突起，提示脑缺血后同侧半球室管膜/室下区附近区域NO产量的降低可能诱发室管膜细胞的增殖。我们的研究发现，在脑缺血后3～14d，即SVZ细胞增殖期间，nNOS的表达降低，且SVZ内nNOS阳性表达的胞体和突起减少，结果与张蓬勃基本一致；川芎嗪作用后nNOS的表达均表现为1～14d明显降低，甚至个别脑片在3～14d时SVZ内未见nNOS阳性表达的胞体和突起，以川芎嗪中、高剂量组较为突出，可见nNOS的表达与SVZ内BrdU标记阳性细胞增殖期(3～14d)和DCX表达阳性的前体细胞的增殖期(1～21d)基本一致。PACKER等[11]的研究发现，成体小鼠脑内nNOS阳性细胞大多数排除于SVZ之外，提示NO为成体小鼠SVZ神经发生的生理性抑制剂。MORENOLOPEZ等[13]进一步对成体小鼠全身给以NOS抑制剂(Nw硝基L精氨酸甲酯，LNAME)，结果发现其对SVZ、RMS和嗅球的有丝分裂细胞产生剂量和时间依赖性增加，且这一作用仅选择性作用于表达nestin的前体细胞，而不是表达神经元或胶质细胞特异蛋白的细胞。提示成体小鼠SVZ和嗅球硝基能神经元产生的NO对未分化的前体细胞的增殖起负性调节作用。综合以上研究，我们推测川芎嗪可能通过抑制脑缺血后SVZ区域NOS的表达，使该区域NO产生减少、NO对神经前体细胞的抑制作用减弱，从而诱导SVZ内细胞增殖明显增加。

　　3.2 脑缺血后SVZ细胞迁移与nNOS表达的关系及川芎嗪的作用

　　目前，关于NOS表达与神经发生中细胞迁移关系的研究结果不尽相同。MORENOLOPEZ等[10]研究显示，NO产生受损时有丝分裂后的细胞迁移并不受影响。而GOZAL等[14]的研究发现，在胚胎发育阶段，nNOS的短暂表达与大鼠脑皮质内神经元的迁移一致，抑制nNOS活性明显降低培养的生后小脑脑片颗粒细胞的迁移指数。张蓬勃等[12]研究发现，脑缺血室管膜/室下区细胞向损伤区迁移时期，胼胝体、梗塞纹状体和皮质周围区域nNOS表达降低，认为脑缺血后NO产生的减少可能诱导了室管膜/室下区细胞向损伤区迁移。以往研究发现，脑缺血后SVZ内增殖细胞通过不同途径向损伤区迁移[11]，BrdU标记阳性细胞迁移高峰期在7～14d而DCX阳性细胞为7～21d。本研究结果显示，脑缺血后3～7d胼胝体、梗塞纹状体和皮质周围区域nNOS表达降低，川芎嗪使缺血后3～14d这些区域nNOS表达明显降低，尤以中、高剂量组最为显著。提示脑缺血后nNOS表达降低，使NO产生减少，可能诱导了SVZ内增殖细胞向损伤区迁移；川芎嗪可能通过抑制nNOS表达而诱导SVZ增殖细胞向损伤区迁移，中、高剂量组作用更为显著。

　　3.3 脑缺血后SVZ细胞分化与nNOS表达的关系及川芎嗪的作用

　　目前，关于nNOS表达与神经发生中细胞分化的关系，多数研究认为nNOS的表达增加可促进增殖细胞的分化。张蓬勃等[12]研究发现，缺血后迁入梗塞区周围纹状体和额叶皮质的室管膜/室下区细胞分化为成熟神经元和星形胶质细胞期间，梗塞区周围纹状体和额叶皮质区域内nNOS的表达增高，而且在此期间，梗塞区周围纹状体和额叶皮质内DiI标记细胞共表达nNOS。提示梗塞区周围纹状体和额叶皮质内NO的产量可能与室管膜/室下区细胞的分化成熟有关，并认为梗塞区周围纹状体和额叶皮质内的室管膜/室下区细胞分化时期该区域nNOS表达增高，可能是由于新生细胞表达了nNOS。有研究发现，脑缺血后21d从SVZ迁移到梗塞区周围纹状体和皮质的新生细胞分化为成熟神经元和胶质细胞，川芎嗪能促进纹状体和皮质的增殖细胞分化为成熟神经元。我们的研究结果显示，21d时梗塞区周围纹状体和皮质区域内nNOS的表达增高，提示梗塞区周围纹状体和皮质区域内NO的产生可能与增殖细胞分化成熟有关。但是，川芎嗪作用后缺血21d时梗塞周围纹状体区域内nNOS表达的增高并不明显，提示川芎嗪促进分化作用并不是主要通过增高nNOS的表达而实现的。

　　3.4 脑缺血后DG内细胞增殖、迁移与nNOS表达的关系及川芎嗪的作用

　　目前，关于NO对SGZ细胞的增殖和迁移作用的研究结果不尽相同。有研究显示，NO能增加齿状回内新生细胞的数量，表明NO对 SGZ内神经干细胞/祖细胞增殖有促进作用。也有研究发现，给与NO抑制剂对成体小鼠海马齿状回的细胞增殖没有作用。PACKER等用微渗透泵向成体大鼠侧脑室内注入LNAME以灭活nNOS，发现nNOS活性降低可增加海马DG 的神经发生，提示NO对SGZ内神经干细胞/祖细胞增殖可能有抑制作用。我们的研究发现，在SGZ细胞增殖期(3～14d)DG和CA1区 nNOS的表达降低，而SGZ的增殖细胞向颗粒细胞层和CA1区迁移时(21d)，DG和CA1 nNOS的表达增加，提示nNOS在脑缺血后不同时间的表达变化参与了SGZ细胞的增殖和迁移。川芎嗪作用后3～21d SGZ细胞呈持续增殖状态[10]，而此时DG和CA1区nNOS的表达呈较低水平，提示川芎嗪可能通过抑制nNOS表达而发挥其促增殖和迁移作用。

　　综上所述，川芎嗪对脑缺血后3～14d 各脑区nNOS的表达有明显抑制作用，但21d时(增殖细胞分化期)对梗塞区周围纹状体和皮质nNOS表达的增高作用不明显。提示川芎嗪可能通过抑制nNOS的表达、减少NO产生，发挥其促进细胞增殖和迁移的作用。

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