硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞能量代谢相关酶活性、细胞周期及凋亡的影响

　　　　作者：赵海军，王宝贵，张桂英，张惠，周静，凌丰，陈敏华

【摘要】 　　目的 探讨硝酸亚铈对于小鼠睾丸细胞能量代谢相关酶类活性、细胞周期以及凋亡的影响。方法 100只雄性小鼠随机分为阴性对照组、环磷酰胺组及硝酸亚铈15、30、60mg/kg组，各组动物用相应受试物连续灌胃60d。采用酶化学方法检测乳酸脱氢酶(LDH)、山梨醇脱氢酶(SODH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)的活性；采用流式细胞仪检测睾丸细胞的细胞周期及细胞凋亡。结果 与环磷酰胺组比较，15mg/kg硝酸亚铈能促进LDH、SODH、SDH及G6PD活性(P<0.05)，30mg/kg硝酸亚铈有促进SDH活性的作用(P<0.05)；15mg/kg和30mg/kg硝酸亚铈均能延长睾丸细胞G0/G1期，缩短S期和G2+M期，抑制细胞凋亡(P<0.05)。与阴性对照组比较，60mg/kg硝酸亚铈对LDH、SDH、G6PD均有显著性抑制作用(P<0.05)，且能缩短睾丸细胞G0/G1期，延长S期和G2+M期，细胞凋亡明显增加(P<0.05)。结论 低剂量的硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞能量代谢相关酶活性和细胞增殖有促进作用，而高剂量硝酸亚铈则表现出明显的抑制作用。

【关键词】 硝酸亚铈；细胞周期；凋亡；生殖毒性

　　ABSTRACT: Objective To explore the effect of cerium nitrate on activity of the enzyme related to energy metabolism， cell cycle and apoptosis of testiculus cell in male mice. Methods A total of 100 male mice were distributed randomly into negative control group， cytoxan group， cerium nitrate groups in low dose (15mg/kg)， medium dose (30mg/kg)， high dose (60mg/kg). Whole mice were given corresponding reagent for 60 days. Enzymechemical method was used to detect the activity of lactate dehydrogenase (LDH)， sorbitol dehydrogenase (SODH)， succinic dehydrogenase (SDH)， glucose6phosphate dehydrogenase (G6PD). Cell cycle and apoptosis of testiculus cell were studied by the way of onefluorescence dying method on flow cytometer. Results 15mg/kg cerium nitrate could promote the activity of LDH， SODH， SDH and G6PD of testiculus cell compared with that of cytoxan (P<0.05). 30mg/kg cerium nitrate could advance the activity of SDH of testiculus cell with cytoxan (P<0.05). 15mg/kg and 30mg/kg cerium nitrate could extend G0/G1 and shorten S and G2+M of cell cycle， inhibit apoptosis compared with cytoxan (P<0.05). 60mg/kg cerium nitrate could inhibit the activity of LDH， SDH and G6PD of testiculus cell with negative control group (P<0.05)， extend S and G2+M and shorten G0/G1 of cell cycle， and increase apoptosis compared with negative control group (P<0.05). Conclusion Lowdose cerium nitrate promotes activity of enzyme related energy metabolism and proliferation of testiculus cell， while highdose cerium nitrate shows adverse effects.

　　KEY WORDS: cerium nitrate; cell cycle; apoptosis; reproduction toxicity

　　中国是稀土资源最多的国家。在所有的稀土元素中铈占稀土总组分的28%，居第一位，发展和利用价值非常高。随着应用的增多，越来越多的铈进入环境，继而通过生物链，导致生物体内和人体内铈的增加，并且铈的摄入具有长期性。因此，摄入后近期、远期的生物安全性就成为一个值得探讨的问题。生殖系统是对有毒有害物质较为敏感的系统之一，所以对生殖系统的影响更值得我们关注。但是，目前国内外有关铈对雄性生殖系统影响的研究较少。本研究以昆明种小白鼠为研究对象，探讨了硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞酶活性、细胞周期以及细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器

　　硝酸亚铈(天津市德兰精细化工厂)；环磷酰胺(上海华联制药有限公司)；氧化型辅酶Ⅰ(上海生物化学试剂商店)；氧化型辅酶II(中国科学院生物化学研究所)；山梨醇(上海化学试剂厂)；葡萄糖6磷酸二钾盐(中国科学院上海生物化学研究所)；乳酸脱氢酶(LDH)测试盒、琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒(南京建成生物工程研究所)；Tris (Sigma公司)；722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；小型三用恒温水箱(北京医疗设备厂)；流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)；低速离心机LD42型(北京医用离心机厂)。

　　1.2 动物分组及处理方法

　　健康昆明种小鼠，雄性100只，体重15～19g，由吉林大学实验动物中心提供。随机分为5组：阴性对照组，给予蒸馏水；3个硝酸亚铈组，剂量分别为15、30、60mg/kg；环磷酰胺组，13mg/kg。每组20只。连续经口灌胃染毒60d。于第61天，脱颈椎处死小鼠，取其睾丸和附睾待测。

　　1.3 睾丸细胞酶活性的测定

　　将小鼠脱颈椎处死后，剪开腹腔，立即取出睾丸并去除被膜，每克睾丸加3mL 0.5mol/L Tris/HCl缓冲液，在冰浴下用玻璃匀浆器制成匀浆，4℃、12000r/min离心15min，取上清液[1]。LDH和SDH活性按照南京建成生物工程研究所提供的方法进行检测，山梨醇脱氢酶(SODH)和葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)活性按照文献给出的方法进行检测[1]。

　　1.4 睾丸细胞周期及凋亡的测定

　　睾丸剥去被膜，加少量磷酸盐(PBS)缓冲液，用眼科剪剪碎，吸管吸打几次，然后用200目尼龙网过滤，800r/min离心5min，弃上清；用PBS缓冲液洗涤两次，制备单细胞悬液，按照文献报告的方法进行流式细胞仪检测[2]。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS 12.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析及LSDt检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞酶活性的影响

　　给予小鼠受试物60d，LDH活性：环磷酰胺组、硝酸亚铈60mg/kg组与阴性对照组比较显著降低(P<0.05)；硝酸亚铈15mg/kg组、30mg/kg组与环磷酰胺组比较显著增高(P<0.05)。SODH活性：硝酸亚铈15mg/kg组与阴性对照组和环磷酰胺组比较显著升高(P<0.05)。SDH活性：硝酸亚铈30mg/kg组、60mg/kg组、环磷酰胺组与阴性对照组比较显著降低(P<0.05)；硝酸亚铈15mg/kg组与环磷酰胺组比较显著升高(P<0.05)。G6PD活性：硝酸亚铈60mg/kg组、环磷酰胺组与阴性对照组比较显著降低(P<0.05)；硝酸亚铈15mg/kg组与环磷酰胺组比较显著升高(P<0.05，表1)。表1 硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞酶活性的影响（略）

　　2.2 不同浓度硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞周期和细胞凋亡的影响

　　给予小鼠受试物60d，G0/G1期睾丸细胞百分数：硝酸亚铈60mg/kg组和环磷酰胺组与阴性对照组比较显著升高(P<0.05)；硝酸亚铈15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg组与环磷酰胺组比较显著降低(P<0.05)。S期细胞百分数：硝酸亚铈60mg/kg组和环磷酰胺组与阴性对照组比较显著降低(P<0.05)；硝酸亚铈15mg/kg组与环磷酰胺组比较显著升高(P<0.05)。G2+M期细胞百分数：硝酸亚铈60mg/kg组和环磷酰胺组与阴性对照组比较显著降低(P<0.05)；硝酸亚铈15mg/kg和30mg/kg组与环磷酰胺组比较显著升高(P<0.05)。细胞凋亡百分数：硝酸亚铈30mg/kg、60mg/kg组和环磷酰胺组与阴性对照组比较明显升高(P<0.05)；硝酸亚铈15mg/kg和30mg/kg组与环磷酰胺组比较明显降低(P<0.05，表2)。表2 硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞周期和细胞凋亡的影响（略）

　　3 讨 论

LDH主要存在于精母细胞、精子细胞胞质及精子尾中段线粒体中，是生精细胞糖代谢生能的主要酶，并与生精上皮的成熟有关[3]。SODH是精子特征性酶之一，在睾丸主要分布于生精小管和精细胞的线粒体内，可作为睾丸成熟、精子功能成熟和形态完善的标志酶[4]。SDH主要位于生精细胞和精子线粒体膜，是进行有氧呼吸的关键酶 [5]。G6PD主要存在于睾丸生精小管的间质细胞、支持细胞和精细胞内，尤以间质细胞中活性最强，是氧化旁路开始时的重要酶。因此，G6PD可作为反映间质细胞功能的指标。间质细胞可分泌雄性激素，有促进精子发生、维持性功能等作用。

本研究结果显示，与环磷酰胺比较，15mg/kg硝酸亚铈能促进LDH、SODH、SDH、G6PD酶活性，30mg/kg对SDH的活性有促进作用。60mg/kg硝酸亚铈与阴性对照对LDH、SDH、G6PD均有显著性抑制作用。这提示高剂量的硝酸亚铈可以通过抑制睾丸细胞多种与能量代谢相关酶的活性进而致使生精细胞能量不足，生精过程受阻，影响精子结构完善和功能成熟；而低剂量的硝酸亚铈则表现出比较明显的增强这些酶活性的作用。这可能与硝酸亚铈的低剂量兴奋效应有关[6]，但具体机制还有待进一步研究。

生殖细胞的细胞周期分为G0、G1、S、G2和M期。生殖细胞在M期需要进行两次减数分裂，使精子(卵子)的染色体呈单倍体。细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmed cell death)，是细胞受高度精密调节、有序地走向消亡的过程[7]。生殖细胞凋亡主要是精原细胞和精母细胞，而且精原细胞凋亡率大于精母细胞，精子细胞和精子则很少发生凋亡[8]。细胞凋亡在生精过程中对维持成熟精子的生成数量和质量有重要作用，但生殖细胞的过渡凋亡也是导致实际生成的精子数量较理论推算精子数少的主要原因[9]。

　　本研究结果显示，与环磷酰胺比较，15mg/kg和30mg/kg硝酸亚铈能延长睾丸细胞G0/G1期，缩短S期和G2+M期，抑制细胞凋亡。60mg/kg硝酸亚铈与阴性对照比较能缩短睾丸细胞G0/G1期，延长S期和G2+M期，细胞凋亡明显增加。这提示高剂量硝酸亚铈可导致睾丸细胞停留在复制前期，细胞凋亡增加。这可能由于铈抑制了睾丸内酶类和睾酮活性，造成DNA含量下降，使睾丸内的生精细胞停留在复制前期、凋亡增加；而低剂量硝酸亚铈对细胞周期及凋亡与能量代谢相关酶类的活性表现出同步性，可以促进睾丸细胞的增殖。

综上所述，低剂量的硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞能量代谢相关酶活性和细胞增殖有促进作用，而高剂量硝酸亚铈则表现出明显的抑制作用，但其确切的分子机制有待进一步研究。

参考文献

　[1]江泉观，于永强. 雄(男)性生殖毒理学——理论与方法 [M]. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社， 1994:206244.

　　[2]宋平根，李素文. 流式细胞术的原理和应用 [M]. 北京：北京师范大学出版社， 1992:8897.

　　[3]AFROMEEV VI， TKACHENKO VN. Change in the percent of lactate dehydrogenase is enzyme level in testes of animals exposed to superhigh frequency radiation [J]. Biofizika， 1999， 44(5):931932.

　　[4]KOBAYASHI T， KANEKO T， IUCHI Y， et al. Localization and physiological implication of aldose reductase and sorbitol dehydrogenase in reproductive tracts and spermatozoa of male rats [J]. J Androl， 2002， 23(5):674683.

　　[5]王水明，王德文，彭瑞云，等. 电磁脉冲辐射对小鼠生精细胞能量代谢的影响 [J]. 中华物理医学与康复杂志， 2003， 25(9):516518.

　　[6]张洪杰，洪广言. 我国稀土化学的发展 [J]. 化学通报， 2001， 64(6):325331.

　　[7]童建孙，孙建伟. 生精细胞的凋亡 [J]. 国外医学计划生育分册， 1996， 15(1):1113.

　　[8]BRINKWORTH MH， WEINBAUER GF， SCHLATT S， et al. Identification on male germ cells undergoing apoptosis in adult rats [J]. J Reprod Fertil， 1995， 105(1):2527.

　　[9]胡静熠. 生精过程中细胞凋亡的基因和激素调控机制 [J]. 国外医学卫生学分册 [J]. 2001， 28(2):6970